第一部分基于GEO/TCGA数据库识别乳腺癌差异基因 GNG2目的:整合GEO和TCGA大样本数据库,采用生物信息学方法筛选出在乳腺癌中具有重要研究价值的差异基因,为进一步发现乳腺癌新的治疗靶点和预后标志物提供理论依据。方法:从GEO数据库下载乳腺癌和正常对照的m RNA表达数据,共计三个芯片(GSE45827,GSE50428,GSE57297),204个样本被纳入差异基因筛选体系,其中乳腺癌样本有181个,正常对照样本有23个。同时,每个芯片所对应的平台注释文件也被下载下来。之后,根据注释文件将探针转换为基因名称(如果一个基因名称对应多个探针,则取平均值)。将三个芯片的原始数据合并之后,利用R(3.5.1)中的Sva包进行批次矫正。接下来,利用R(3.5.1)中的limma包对矫正后的数据进行差异分析,筛选标准为:FDR≤0.05,|log Fold Change(FC)|≥1,adjust P≤0.01,并利用TCGA数据库对筛选的差异基因进行验证。随后,使用R(3.5.1)中的pheatmap包对差异基因进行聚类分析;使用R(3.5.1)中的Cluster Profiler包对差异基因进行GO和KEGG注释(adjust P<0.05;FDR<0.05);使用STRING在线工具(可信度>0.7)和Cytoscape软件绘制蛋白互作网络图;使用Kaplan–Meier plotter在线工具进行核心基因的生存分析。结果:基于3个芯片的联合分析,共筛选出1321个差异基因,其中上调基因有624个,下调基因有697个。GO注释表明,大部分差异基因主要位于细胞外基质,且主要功能为细胞黏附分子的结合以及主要参与细胞外组织架构的构建等生物进程。KEGG通路分析表明,差异基因主要参与PI3K-AKT信号通路。更为重要的是,基于构建的蛋白互作网络分析发现GNG2处于整个互作网络的核心位置,在乳腺癌中呈现明显低表达且参与调控绝大部分的下调差异基因,并参与PI3K-AKT信号通路的调节,Kaplan Meier生存分析也表明GNG2低表达与不良的患者总体生存率和无病生存期明显相关,提示GNG2在乳腺癌的发生发展中具有极其重要的研究价值。结论:基于GEO数据库中的三个芯片联合分析,筛选获得了乳腺癌的差异表达谱,通过蛋白-蛋白互作网络分析揭示了差异基因GNG2可能在乳腺癌的发生发展中发挥重要作用。第二部分GNG2过表达能够抑制乳腺癌细胞的增殖目的:于体内外探究GNG2过表达对乳腺癌细胞增殖的影响方法:利用TCGA和GEPIA在线数据库进一步证实GNG2在乳腺癌中呈现低表达。选取MCF-7和MDA-MB-231两种乳腺癌细胞系,转染GNG2过表达慢病毒和对照病毒后,流式细胞术筛选稳定过表达GNG2和GFP的细胞株。采用CCK-8、平板集落形成实验、流式细胞术等实验方法于体外研究GNG2过表达对乳腺癌细胞增殖、凋亡和周期的影响。提取细胞蛋白和总RNA,Q-PCR和Western blot检测增殖标志蛋白Ki-67、抗凋亡蛋白Bcl-2、周期激活蛋白Cyclin D1的表达。共培养稳定过表达GNG2的乳腺癌细胞和3T3-L1成熟脂肪细胞,研究GNG2过表达对脂肪因子诱导的乳腺癌细胞增殖的影响。裸鼠皮下成瘤实验于体内研究GNG2对乳腺癌增殖的影响。结果:GNG2在乳腺癌中呈现明显低表达,乳腺癌细胞系中的GNG2表达很低,Western blot几乎检测不出。通过转染过表达慢病毒,成功构建了稳定过表达GNG2的MCF-7和MDA-MB-231两种细胞株。体外实验结果表明GNG2过表达能够明显地抑制乳腺癌细胞的增殖,促进细胞凋亡,延长细胞周期进程(即出现G1期阻滞)。Q-PCR和Western blot也表明GNG2过表达能够明显抑制增殖标志蛋白Ki-67、周期激活蛋白Cyclin D1和抗凋亡蛋白BCL-2的m RNA和蛋白水平。此外,GNG2过表达也能够明显地抑制脂肪因子所诱导的乳腺癌细胞增殖。并且,体内实验结果也进一步证实了GNG2能够抑制乳腺癌细胞的增殖。结论:体内和体外实验均表明GNG2能够抑制乳腺癌细胞的增殖,同时,对于脂肪因子所诱导的乳腺癌的增殖,GNG2也有较明显地抑制作用。第三部分GNG2调控乳腺癌细胞增殖的机制研究目的:探究GNG2抑制乳腺癌细胞增殖的具体机制。方法:通过Western blot结合KEGG通路分析,明确GNG2对所参与的信号通路的具体影响。Q-PCR筛选GNG2下游的关键分子,明确GNG2对MRAS的正向调控作用。转染MRAS抑制质粒,明确GNG2发挥肿瘤抑制作用是否是MRAS依赖性的。结果:GSEA分析结果表明,GNG2可能通过多种机制抑制乳腺癌细胞的增殖,包括:促进细胞凋亡和细胞的免疫应答,抑制肿瘤的氧化磷酸化途径、不饱和脂肪酸的生物合成、剪切体的形成和DNA的复制等。而KEGG分析发现GNG2可能通过RAS-ERK和RAS-PI3K-AKT等途径抑制细胞增殖。Western blot结果证实GNG2的确能够抑制ERK和AKT的磷酸化。RAS家族存在四种亚蛋白(包括HRAS、KRAS、MRAS、NRAS)。通过Q-PCR筛选发现GNG2仅能影响MRAS的表达,而对NRAS、KRAS、HRAS无明显的调控作用,Western blot结果也进一步证明GNG2上调能够诱导MRAS的表达。抑制了MRAS的表达之后,GNG2对ERK和AKT活性的调节作用便不复存在,提示GNG2对AKT和ERK活性的调节作用是MRAS依赖性的。结论:生物信息学分析提示,GNG2可能通过多条途径抑制细胞的增殖。实验结果证实GNG2可以抑制AKT和ERK的活性,且该抑制作用是MRAS依赖性的。第四部分GNG2的表达与乳腺癌临床病理特征的相关性分析目的:利用从TCGA下载的乳腺癌患者的临床资料评估GNG2与乳腺癌患者临床病理特征的相关性。方法:进入TCGA官网(https://portal.gdc.cancer.gov/),下载乳腺癌患者的临床数据和m RNA表达数据。针对m RNA表达数据,使用perl语言将1230个样本的所有基因的m RNA表达值合并成为一个矩阵后,提取单基因GNG2在所有样本中的表达值,根据GNG2表达值的中位值将样本分为高低表达两个组。针对临床数据,提取样本ID、年龄、TNM分期、生存时间、ER状态、PR状态、HER2状态等临床信息,并删除缺失值。使用R(3.5.1)软件对提取的临床数据与单基因GNG2的样本表达值逐一进行逻辑回归分析、单因素Cox分析和多因素Cox分析,记录下相应的95%置信区间和P值,整理成表。使用SPSS统计软件,绘制ROC曲线,评估GNG2在乳腺癌患者中的诊断价值。结果:从TCGA官网共下载1109个乳腺癌样本和121个正常对照组织样本。逻辑回归分析表明,GNG2低表达与高分期(II期与I期相比;OR=0.616;P=0.004)、较大的肿瘤直径(肿瘤直径≥2cm与直径<2cm相比;OR=0.584;P<0.001)、肿瘤发生与否(有肿瘤与无肿瘤相比;OR=0.091;P<0.001)、年龄增长(OR=0.681;P<0.001)存在明显相关性。单因素Cox分析和多因素Cox分析均表明,GNG2低表达与乳腺癌病人的总体生存率降低明显相关(P<0.05),另外,年龄与乳腺癌的生存状态也呈现了较弱的相关性(OR接近1;P<0.05)。ROC曲线得出GNG2同时也能较好地用于乳腺癌的诊断(AUC=0.887;P<0.001)。结论:GNG2低表达是乳腺癌患者不良预后的独立预测指标,同时,GNG2还可作为乳腺癌的一个较好地诊断标志物。