五味子叶多糖提取及其对阿尔茨海默症模型小鼠作用研究

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目的本文提取五味子Schisandra chinensis叶中多糖,研究五味子叶多糖对阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)模型小鼠的作用,并探究其治疗AD的作用机制,为五味子叶的开发利用提供理论基础。方法(1)采用回流法提取五味子叶粗多糖,单因素试验分别考察液料比、提取温度和提取时间对五味子叶粗多糖提取率的影响,并采用Box-Behnken响应面分析法优化得出五味子叶粗多糖的最佳提取工艺,并对五味子叶粗多糖进行除杂质,除杂质后为五味子叶多糖(Schisandra chinensis Leaves polysaccharide,SCLP)。(2)采用紫外可见分光光度计测定SCLP中总糖、糖醛酸、蛋白质的含量,采用红外光谱(FT-IR)分析SCLP的化学键或官能团,采用凝胶色谱-示差-多角度激光光散射系统(GPC/SEC–MALS)测定SCLP均重分子量,采用薄层色谱法(TLC)分析SCLP的单糖组成,采用差示扫描量热分析(DSC)和X射线衍射仪(XRD)分别测定SCLP热稳定和晶体结构。(3)以Vc为对照,采用分光光度法考察SCLP的总还原力及对DPPH·、ABTS+·、·OH-及·O2-的清除能力,并计算对各自由基的半数有效浓度(half-maximal effective concentration,EC50),分析抗氧化能力。(4)采用三氯化铝(Al Cl3)联合D-半乳糖(D-gal)建立BABL/c小鼠AD模型,通过Morris水迷宫(Morris Water Maze,MWM)和新物体识别试验(Novel Object Recognition,NOR)分别检测AD小鼠学习记忆能力的变化,采用酶联免疫法测定TNF-α、IL-1、Aβ、ZO-1及D-Lac含量,采用Western blot检测AD模型小鼠海马组织中BACE1和AMPK的表达,16S r RNA基因多样性测序法分析各组小鼠粪便中的微生物,探究SCLP对AD小鼠治疗的作用机制。结果(1)单因素考察发现液料比、提取温度和提取时间均对五味子叶粗多糖提取率有影响,得到五味子叶粗多糖最佳提取工艺为:液料比为31:1(m L/g),提取时间为245 min,提取温度为81℃,五味子叶粗多糖提取率为7.08%;SCLP的提取率约为2.83%。(2)SCLP中总糖含量为65.21±2.15%,糖醛酸含量为16.42±1.65%,蛋白质含量为5.61±0.51%;FT-IR分析表明SCLP含有多羟基醛糖的特征吸收峰;GPC/SEC–MALS分析表明SCLP的重均分子量(Mw)为2.21×10~6Da;TLC分析表明SCLP的单糖组成有Glu、Gal、Rha、Xyl、Ara、Man、Glc A、Gal A和Rib;DSC表明SCLP具有较好的热稳定性;XRD分析表明SCLP是无定形聚合物。(3)SCLP的体外抗氧化活性试验表明,SCLP在一定范围内,其总还原力和对DPPH·、ABTS+·、·OH及·O2-的清除率因浓度的升高而增大,且存在明显的量效关系,清除自由基的EC50值分别为0.735 mg/m L、0.626 mg/m L、1.677 mg/m L、0.253 mg/m L。(4)药理实验表明SCLP提高AD模型小鼠的学习与记忆能力,降低AD模型小鼠的炎症和Aβ,改善AD模型小鼠肠道功能,抑制海马组织中BACE1表达和升高AMPK的表达。同时,16S r RNA测序结果显示,AD模型小鼠肠道菌群紊乱,SCLP具有调节AD模型小鼠肠道菌群的结构组成及功能的作用。结论本文通过单因素考察和利用响应面设计试验优化方案得到提取五味子叶粗多糖的最佳工艺并发现SCLP有抗氧化活性;另外,发现SCLP通过调节肠道菌群和肠脑轴,及抑制BACE1表达和升高AMPK的表达对AD模型小鼠具有治疗作用。本课题对预防及治疗AD和五味子非药用资源的合理开发和利用提供了科学依据。
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