目的:功能性便秘(FC)是临床常见的慢性难治性疾病,针刺治疗FC疗效持久安全,优势突出,但针刺治疗FC的具体机制尚未明晰。基础研究表明肠道菌群紊乱引起胃肠传输功能失常,是导致FC迁延难愈的核心病理环节。因此,本研究以肠道菌群为切入点,从与胃肠传输功能密切相关的短链脂肪酸(SCFAs)、5-HT入手,比较观察针刺对FC模型小鼠和伪无菌(PGF)模型小鼠的影响,拟通过正、反两面深入探讨和揭示针刺合募穴调控肠道菌群,改善胃肠传输功能,从而治疗FC的分子机制。为针刺治疗FC的临床推广应用提供科学依据。方法:将40只雌性昆明小鼠随机分为空白组(NC)、功能性便秘模型组(FC)、功能性便秘+电针组(FC+EA)、伪无菌模型组(PGF)、伪无菌模型+电针组(PGF+EA)。FC组、FC+EA组采用复方地芬诺酯灌胃法建立FC模型小鼠。PGF组、PGF+EA组采用抗生素鸡尾酒法清除小鼠肠道菌群建立PGF模型小鼠。连续造模14天,各组小鼠禁食不禁水12 h后,给予活性炭混悬液0.1 ml灌胃,记录小鼠首粒黑便排出时间,以与NC组小鼠数据有显著的统计学差异(P<0.01)为判定模型成功的标准。造模成功后,各组小鼠仍继续按上述方法造模以维持模型的稳定,FC+EA组与PGF+EA组在造模后1 h,给予电针治疗,选取同侧“天枢”、“上巨虚”,左右交替进行,疏密波,电流强度以小鼠肢体末端轻微抖动为宜,留针30 min,每天1次,5次一个疗程,疗程之间休息2天,共治疗2个疗程。最后一次治疗结束后,观测以下紧密联系的四部分内容。1.收集记录各组小鼠首粒黑便的排出时间、8 h内排粪粒数及重量、粪便含水率。结合胃排空率、小肠推进率评价各组小鼠胃肠道传输功能,采用HE染色法检测远端结肠的病理形态学变化。直观地观察针刺合募穴对FC模型小鼠和PGF模型小鼠胃肠道传输功能的作用差异。2.提取小鼠结肠内容物中DNA,采用16S r RNA高通量测序法检测各组小鼠结肠内容物中菌群的多样性及结构组成的变化情况,分析和评价针刺合募穴对FC模型小鼠和PGF模型小鼠肠道菌群的调控差异。3.采用GC-MS法检测各组小鼠结肠内容物中SCFAs含量的变化情况,分析和评价针刺合募穴对FC模型小鼠和PGF模型小鼠肠道菌群主要代谢产物SCFAs的影响差异。4.采用Elisa法检测各组小鼠结肠5-HT的含量,RT-q PCR和Western Blot分别检测结肠5-HT4R、SERT的基因和蛋白表达情况,分析和评价针刺合募穴对FC模型小鼠和PGF模型小鼠结肠5-HT及其受体、转运酶的影响差异。结果:1.胃肠传输功能变化情况:(1)与NC组比较,FC组小鼠首粒黑便排出时间显著延长(P<0.01),8 h内排粪粒数、重量、粪便含水率显著减少(均P<0.01),小肠推进率、胃排空率显著下降(均P<0.01),仅个别结肠组织样本出现轻微病损,无严重的病理形态损伤。与FC组比较,FC+EA组小鼠首粒黑便排出时间显著缩短(P<0.05),8 h内排粪粒数、重量、粪便含水率显著增加(均P<0.05),小肠推进率、胃排空率显著上升(均P<0.01),表明针刺能够明显提高FC模型小鼠胃肠传输功能,改善小鼠便秘症状。(2)与NC组比较,PGF组小鼠8 h内排粪粒数、小肠推进率、胃排空率均显著减少(均P<0.01),首粒黑便排出时间显著延长(P<0.01),提示PGF小鼠出现胃肠传输功能障碍。与PGF组比较,PGF+EA组小鼠仅小肠推进率明显加快(P<0.01),而首粒黑便排出时间、胃排空率均无统计学差异(均P>0.05),表明肠道菌群不存在的情况下,针刺对胃肠传输功能的提高作用被抑制,提示调控肠道菌群是针刺提高胃肠传输功能的关键环节。2.菌群多样性变化情况:(1)与NC组比较,FC组小鼠肠道菌群丰富度指数(observed species与Chao1)显著下调(均P<0.05),多样性指数(Shannon与Simpson)不具有统计学差异(均P>0.05),但存在下调趋势,厚壁菌门以及乳酸杆菌科、葡萄球菌科的相对丰度减少,拟杆菌门、变形菌门以及鼠杆菌科、肠杆菌科的相对丰度增加,肠道菌群物种结构组成的整体变化以减少正常占比较高菌门的相对丰度、增加正常占比较低菌门的相对丰度为特征。与FC组比较,FC+EA组小鼠肠道菌群丰富度与多样性不具有统计学差异(均P>0.05),但存在上调趋势,拟杆菌门及其分类下的鼠杆菌科、大肠杆菌科中微生物减少,厚壁菌门及其分类下的葡萄球菌科中微生物增加,拟杆菌门/厚壁菌门比值(B/F)比例以及肠道菌群整体结构变化趋向NC组小鼠。(2)与NC组比较,PGF组小鼠丰富度指数(observed species)与多样性指数(Shannon)均显著下降(均P<0.05),厚壁菌门、拟杆菌门等大部分菌群被清除。与PGF组比较,PGF+EA组小鼠Alpha多样性指数均无统计学差异(均P>0.05),物种结构组成变化不明显,表明抗生素处理成功抑制了针刺对小鼠肠道菌群的调控作用。3.短链脂肪酸的变化情况:(1)与NC组比较,FC组小鼠结肠内容物中SCFAs变化无统计学差异(均P>0.05)。与FC组比较,FC+EA组小鼠丁酸显著上升(P<0.05),其余SCFAs变化无统计学差异(均P>0.05)。相关性分析发现葡萄球菌科与丁酸呈显著正相关(r=0.74,P<0.01),推测针刺可能通过上调葡萄球菌科中微生物增加丁酸的含量。(2)与NC组比较,PGF组小鼠结肠内容物中SCFAs显著减少(均P<0.01)。与PGF组比较,PGF+EA组小鼠结肠内容物中SCFAs的变化无统计学差异(均P>0.05),提示肠道菌群是针刺介导SCFAs产生的物质基础。4.5-HT及其受体、转运酶的变化情况:(1)与NC组比较,FC组小鼠结肠5-HT浓度及其5-HT4受体基因和蛋白表达水平显著下降(均P<0.01),SERT基因和蛋白表达水平显著上升(均P<0.01)。与FC组比较,FC+EA组小鼠结肠5-HT浓度及其5-HT4受体基因和蛋白表达水平显著上调(均P<0.05),SERT基因和蛋白表达水平虽然不具有统计学差异(均P>0.05),但存在下调趋势,表明针刺能够促进5-HT合成分泌、抑制其转运灭活,并激活了与促进肠道动力密切相关的5-HT4受体的基因和蛋白表达。(2)与NC组比较,PGF组小鼠结肠5-HT浓度及其5-HT4受体基因和蛋白表达水平显著下降(均P<0.01)。与PGF组比较,PGF+EA组小鼠结肠5-HT浓度及其5-HT4受体基因和蛋白表达水平变化无统计学差异(均P>0.05),表明肠道菌群不存在的情况下,针刺对5-HT及其5-HT4受体的作用被抑制,提示肠道菌群是针刺影响结肠5-HT、5-HT4受体表达的关键因素。结论:1.针刺合募穴能够提高FC模型小鼠的胃肠传输功能,与恢复紊乱的肠道菌群整体结构密切相关。2.针刺合募穴可能通过上调FC模型小鼠葡萄球菌科微生物,介导了丁酸的产生,从而刺激5-HT及5-HT4受体表达,提高了胃肠传输功能,发挥治疗FC的作用。3.在肠道菌群被清除的情况下,针刺对胃肠传输功能、SCFAs、5-HT及5-HT4受体的调控作用被抑制,从反面证实了调控肠道菌群是针刺治疗FC的关键环节。