[目的]器官移植术后需要使用广谱免疫抑制剂治疗器官移植术后免疫排斥,寻求一种可替代或减少免疫抑制剂使用或增加免疫靶向性的方法。课题结合转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor β1,TGF-β1)的免疫抑制、免疫调节作用与间充质干细胞的低免疫原性、免疫抑制性的特性,构建比格犬TGF-β1基因过表达慢病毒载体,转染比格犬骨髓间充质干细胞(Canine mesenchymal stem cells,cMSCs)并进行鉴定。[方法]1、采用OligoMix(?)寡核苷酸合成法得到全基因,PCR进行比格犬TGF-β1目的基因纯化,琼脂糖电泳回收并鉴定目的基因片段。以获取的目的基因(犬)TGF-β 1 与慢病毒载体利用 ClonExpress(?)Entry One Step Cloning Kit 将两者连接构建携带目的基因的LV5载体。培养制备以大肠杆菌为媒介的感受态细胞,以氯化钙法完成菌悬液转染感受态细胞。抽提质粒行双酶切鉴定,并将阳性克隆与目的基因(犬)TGF-β 1进行测序比对,用于后续实验。2、首先选用购进的293T细胞进行细胞复苏、计数、传代、冻存。采用以经过传代处理的293T细胞制备包装培养皿,以贴壁细胞达到80%-90%为宜。将无血清DMEM+辅助质粒V9120+慢病毒包装质粒按比例混匀加入RNA i-Mat e试剂中室温融合后接种于包装培养皿开始培养。将培养后细胞悬液离心收集及浓缩病毒液,进行病毒滴度检测。3、比格犬全麻下行骨髓穿刺术获取骨髓组织,密度梯度离心与贴壁培养法相互配合分离、培养细胞。当贴壁率大于90%时开始传代培养。第三代传代细胞根据惯用MSC判定标准予培养、鉴定,冻存备用。4、配置细胞感染液与含犬TGF-β1的病毒液和cMSCs,共同混合在24孔板中培养,在24小时、48小时、144小时进行显微镜和荧光显微镜观察、拍照,并进行嘌吟霉素(Puromycin,PM)抗性病毒筛选,确定最佳感染率。以筛选得出的最佳抗性病毒维持培养cMSCs-TGF-β1细胞,并采用定量即时聚合酶链锁反应(Quantitative real time polymerase chain reaction,Q-PCR)检测及蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测TGF-β1-LV5慢病毒载体转染cMSCs后目的基因TGF-β1的转录和表达情况。[结果]成功提取TGF-β 1目的基因通过重组克隆与LV5载体相连,在转染感受态细胞后收取质粒,经过琼脂糖检测及与目的基因测序后证实成功获得表达目的基因的阳性质粒,并成功构建TGF-β1-LV5慢病毒载体病毒悬液。MSC经过细胞形态学观察,24 h后出现单个的贴壁细胞,量少无聚集;48小时后可见有大小不一、形态不规则的贴壁细胞,逐渐有聚集生长现象;5-7天,细胞生长较前逐渐加快,从初现长条梭形细胞逐渐融合成漩涡状排列,达到传代条件。犬骨髓间充质干细胞经过抗体检测显示:CD90、CD105(+),CD45(-),并可成功诱导成脂及成骨组织。TGF-β1-LV5慢病毒载体转染cMSCs细胞,在48小时及144小时观察到荧光及蛋白表达;Puromycin抗性病毒筛选:4ug/ml为最佳Puromycin筛选浓度,培养第9天荧光显微镜镜下可得到80%以上感染率。定量即时聚合酶链锁反应(Quantitative real time polymerase chain reaction,Q-PCR)、Western blot检测结果显示TGF-β1高表达。[结论]TGF-β 1-LV5慢病毒载体构建成功;比格犬提取骨髓组织经过细胞分离、培养鉴定为犬骨髓间充质干细胞,且浓度达预期;转染比格犬骨髓间充质干细胞后,实验平均转染率在80%以上,获得高表达TGF-β 1细胞株。[展望]通过提取生物体骨髓组织分离、培养、鉴定获得犬骨髓间充质干细胞,在经TGF-β 1慢病毒转染,成功获得cMSCs-TGF-β1细胞,为后续T细胞共培养检测Tregs细胞研究及比格犬胰肾联合移植诱导自体免疫耐受提供前期实验基础。