基因治疗现已成为攻克肿瘤最具希望，也是研究最为活跃的领域。基因导入系统是基因治疗的核心技术。现阶段面临的最大难题在于尚未找到理想的基因载体，治疗基因的导入仍然是肿瘤基因治疗的瓶颈。非病毒载体近年来发展迅速，其中聚乙烯亚胺(polyethylenimine PEI)是近年来研究最为广泛的阳离子多聚物非病毒基因载体，然而，聚乙烯亚胺作为基因载体使用存在三个突出问题：第一，转染效率与细胞毒性存在矛盾。小分子PEI虽细胞毒性低，但转染效果差，高分子量PEI虽具有较理想转染效率，但细胞毒性强；第二，体液环境中稳定性与穿膜能力存在矛盾。为增加复合物体液环境中的稳定性，应提高PEI/DNA复合物的亲水性，但同时穿膜能力也因而受到影响，使转导效率显著降低。第三，聚乙烯亚胺靶向性差，解决靶向性问题已成为非病毒载体中最为关注的问题。基于以上分析，本课题首先采用Pluronic P123连接低分子量聚乙烯亚胺(PEI2000)，得到多分枝状或网状结构的高分子量PEI衍生物，然后利用整合素αvβ3在人多数肿瘤细胞和肿瘤新生血管高表达的特点，选择特异亲和该整合素的RGD短肽，与细胞穿膜肽TAT(49-57)连接，合成具有靶向于αvβ3和促进载体穿膜的含RGD和TAT(49-57)双功能肽RGDC-TAT(命名为R13)，利用交联技术将R13与PEI衍生物偶联，从而构建新型非病毒基因载体系统P123-PEI-R13，并考察该系统细胞穿膜及胞内转运、释放机制。本课题针对PEI作为基因载体使用中存在的问题，旨在保证较高转染效率情况下，降低PEI细胞毒性，增加其对肿瘤细胞及其新生血管的靶向性，进而提高基因的细胞摄取水平和转染效率，提高肿瘤的基因治疗效果，为基因治疗探索一条有效的途径。本课题第一部分内容是P123-PEI-R13合成与表征。首先采用固相法制备双功能肽R13（RGDC-TAT），并通过电喷雾质谱分析鉴定其序列，通过HPLC测定其相对百分含量，通过表位肽标记的HRP来检测R13与整合素阳性的Hela细胞与B16细胞的体外结合。进而采用三光气+琥珀酰亚胺法活化Pluronic P123，并以其为反应剂交联PEI2KDa，得到高分子量PEI衍生物P123-PEI，再选择SMCC法将R13按不同反应比与P123-PEI偶联，得到目的产物P123-PEI-R13，各反应产物通过IR或1H-NMR进行结构分析。结果表明，成功合成了双功能肽R13，其序列为Arg-Gly-Asp-Cys-Arg-Lys-Lys-Aarg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg（RGDCRKKRRQRRR），纯度为95.8677%，同时R13体外具有亲和整合素αvβ3阳性细胞的能力；成功采用三光气+琥珀酰亚胺法活化P123并交联PEI2KDa，同时成功采用SMCC法将双功能肽R13与P123-PEI偶联，红外、核磁等结构表征表明目的产物修饰度高、纯度好，表明所选合成方法稳定、可控、重复性好。本课题第二部分内容是P123-PEI-R13理化性质。通过测定P123-PEI-R13在37℃下不同时间点分子量的方法评价其水解性能，采用琼脂糖凝胶电泳阻滞分析考察其缩合DNA能力以及对质粒DNA抗DNase I、FBS和肝素钠酶解及解离能力，利用透射电镜观察复合物形态，使用激光粒度仪和zeta电位仪测定粒径、电位，采用MTT法评价合成的P123-PEI-R13对Hela细胞、B16细胞的毒性，并与PEI25kDa对照。结果表明，聚合物P123-PEI-R13在37℃可缓慢水解，大约60h左右可水解成小分子化合物，其水解过程可用一级动力学方程描述。P123-PEI-R13/DNA复合物呈近似球形的胶束样结构，粒径在100-300nm之间，电位适中。P123-PEI-R13与DNA质量比为2时能与DNA完全结合，同时可抵抗高达280μg/mL的肝素钠、50%的FBS及6UDNase I/DNA的解离或酶解。相比较PEI25kDa，P123-PEI-R13细胞毒性显著降低。本课题第三部分内容是P123-PEI-R13/DNA纳米复合物体内外转染。以绿色荧光蛋白质粒pEGFP-N2和虫荧光素酶质粒pGL3-Control作为报告基因，评价其对Hela人宫颈癌细胞、B16小鼠黑色素瘤细胞及HepG2人肝癌细胞转染能力，采用流式细胞仪和发光仪测定绿色荧光蛋白表达阳性细胞百分率和转染细胞的虫荧光素酶活性，分别定性定量考察P123-PEI-R13对各受试细胞体外转染效率，同时，构建肿瘤模型，以虫荧光素酶质粒pGL3-Control作为报告基因，评价P123-PEI-R13递送DNA时在体内的分布与转染效率。体外转染试验表明，在考察的w/w范围内，随w/w比提高，转染效率有逐渐增强的趋势；随R13修饰比提高，转染效率有逐渐下降趋势；整体而言，P123-PEI-R13在各细胞转染远好于PEI2KDa，也好于P123-PEI，比PEI25KDa略强或近似。体内转染试验表明，P123-PEI-R13在HepG2人肝癌移植模型与B16小鼠黑色素瘤移植模型转染情况类似，整体转染能力较P123-PEI与PEI25KDa强，同时也改善了复合物的体内分布，并且由于R13的修饰，使其在肿瘤组织转染效率显著提高，可知聚合物P123-PEI-R13在体内有较强的肿瘤靶向能力，但与其对二种肿瘤细胞的体外转染相比效率要低。本课题第四部分内容是P123-PEI-R13/DNA纳米复合物穿膜及胞内转运、释放机制的研究。本部分采用加入不同内吞途径抑制剂对转染效率是否产生影响的方法，考察复合物内吞途径；采用加入内涵体-溶酶体酸化抑制剂、细胞骨架和动力蛋白抑制剂对转染效率是否产生影响的方法，考察复合物细胞内转运机制；采用细胞因子及细胞内环境是否影响复合物稳定性的方法，考察复合物在细胞内的解离；采用荧光标记聚合物并结合激光共聚焦显微镜考察复合物在细胞内的实时定位。结果表明，P123-PEI-R13修饰R13后，使其细胞摄取表现出了不同特性，P123-PEI-R13/DNA复合物可通过网格蛋白介导的内吞、小窝蛋白介导的内吞及巨胞饮三条途径内吞入胞，并可能有不依赖能量的非内吞途径存在。P123-PEI-R13/DNA复合物入胞后首先经内涵体-溶酶体系统酸化过程而从中逃逸，并以微管为轨道和方向，以动力蛋白为动力来源，在微丝作用下，并有中间纤维协助，向微管“-”端，即细胞核方向转运。RNA与P123-PEI-R13具有更强亲和性，P123-PEI-R13/DNA复合物在细胞核内被RNA解离，从而释放DNA。本课题通过Pluronic P123连接低分子量PEI制备高分子量PEI衍生物，并利用交联技术将双功能R13与该衍生物偶联，研制新型具有主动靶向αvβ3作用并且具有高转染效率、低毒性的阳离子聚合物/DNA纳米复合物，并探讨其细胞穿膜及胞内转运、释放机制，为解决目前基因给药方式存在的问题和实际应用打下基础，本课题研究内容有着一定的理论意义和实践应用价值。