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目的:膀胱癌是全球第九大最常见的恶性疾病,膀胱癌主要是尿路上皮的多种病理学病变,它被认为主要是由于环境因素引起,包括吸烟等。基底细胞可能是膀胱癌起源的细胞,在肿瘤微环境相关的各种刺激下发展为膀胱癌。虽然膀胱癌的一线治疗方法（如经尿道切除,膀胱内注射卡介苗（BCG）,化学疗法或靶向药物（如贝伐珠单抗、西妥昔单抗、舒尼替尼等）对膀胱癌进行治疗等）,临床已经证实能够在一定程度上起到控制膀胱癌的作用,但在基础研究方面,对于膀胱癌发生、发展的机制研究仍显着不足。本文主要研究肿瘤微环境的低氧环境通过下调mi RNA及其下游蛋白,促进膀胱癌肿瘤免疫逃逸机制。方法:表型研究:为了验证在膀胱癌低氧环境下,mi RNA生成异常对膀胱细胞免疫逃逸的影响,首先对人源的外周血单核细胞（PBMCs）进行低氧处理后通过q PCR检测其中核糖核酸酶（Drosha）和核糖核酸内切酶（Dicer）基因m RNA的表达量。进一步利用流式细胞仪和western blot检测细胞内Drosha和Dicer表面蛋白,同时,western blot检测了缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的表达。为了进一步研究低氧环境是否能对膀胱癌细胞的免疫逃逸产生影响,采用流式细胞仪检测免疫细胞活性及免疫检查点程序性死亡受体-1（PD-1）的表达,同时利用酶联免疫吸附测定（Elisa）进一步检测了细胞免疫因子白细胞介素-2（IL-2）以及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量。接着,利用流式细胞仪对肿瘤细胞凋亡情况进行检测。利用western blot检测了PBMC细胞中卡西塔斯B淋巴瘤b（Cbl-b）蛋白（可能参与细胞的免疫逃逸）表达。机制研究:为了进一步验证Cbl-b在肿瘤免疫逃逸中的作用,构建了Cbl-b的过表达载体,并转染至细胞中,利用western blot检测其表达效率。随后,在缺氧条件下,加入Cbl-b si RNA干扰,再western blot验证其蛋白表达量。接着利用流式检测了Cbl-b过表达/缺氧条件下加入Cbl-b si RNA干扰后免疫细胞CD3,CD4以及CD8的阳性表达。同时,利用Elisa进一步检测了Cbl-b过表达/缺氧条件下加入Cbl-b si RNA干扰后细胞免疫因子IL-2以及TNFα的含量。此外,还利用流式细胞仪检测了Cbl-b过表达/缺氧条件下加入Cbl-b si RNA干扰后肿瘤细胞凋亡情况。进一步利用生信分析预测mi R-30c、mi R-135a、mi R-27a与结合靶基因的位点,并构建含有Cbl-b序列及其突变的荧光素酶报告载体,用作进一步验证。接着在mi R-30c、mi R-135a、mi R-27a inhibitor的作用下,利用western blot检测Cbl-b蛋白的表达变化。建立si Drosha,si Dicer si RNA,si Drosha+si Dicer双干扰组（简称Both-si）模型后,q PCR检测了多种mi RNAs的表达水平,western blot检测Cbl-b蛋白表达水平。同时,利用流式检测干扰Drosha和Dicer表达后CD3,CD4以及CD8的阳性表达,以及Elisa检测细胞因子的含量。体内研究:首先构建动物成瘤模型,将构建好的si Drosha,si Dicer si RNA,Both-si肿瘤细胞接种到小鼠皮下,并定期测量瘤体体积。然后,对血清细胞因子进行检测,通过将肿瘤组织进行剥离、固定、病理切片后,然后进行HE染色,Tunel染色,免疫组化等实验方法对体外实验结果进行验证。结果:表型研究:研究发现经过低氧处理后Drosha、Dicer m RNA有明显的下降,蛋白丰度也有明显下降。这一结果提示低氧处理可以降低PBMC细胞中Drosha和Dicer表达。在免疫细胞活性的检测中,我们发现低氧条件下免疫细胞CD3+/CD4+双阳性增加,而CD3+/CD8+双阳性明显降低。此外,CD8T细胞中PD-1的表达上调;低氧条件下细胞免疫因子IL-2和TNF-α的含量明显降低。肿瘤细胞凋亡的检测结果表明,低氧条件下细胞凋亡明显下降。以上结果均提示低氧环境能促使膀胱癌细胞发生免疫逃逸。机制研究:Cbl-b表达的检测结果显示,缺氧条件下PBMC细胞中Cbl-b蛋白表达量显著上升。构建的Cbl-b的过表达载体,其转染效率经过western blot验证,确定了Cb1-b过表达后其蛋白水平显著升高,缺氧条件下加入Cbl-b si RNA干扰,其蛋白表达量则显著降低。免疫细胞的检测结果发现过表达Cbl-b后CD3+/CD4+双阳性增多,而CD3+/CD8+双阳性明显降低,CD8+/PD-1表达上调,表明过表达Cbl-b后肿瘤细胞发生了免疫逃逸;而在缺氧条件下加入Cbl-b si RNA干扰后,CD3+/CD4+双阳性减少,而CD3+/CD8+双阳性增多,CD8+/PD-1表达恢复正常。细胞免疫因子的检测结果表明Cbl-b过表达后IL-2以及TNF-α的含量明显降低,而在缺氧条件下加入Cbl-b si RNA干扰后则会发生恢复。细胞凋亡的检测结果表明Cbl-b过表达后细胞凋亡明显下降,而在缺氧条件下加入Cbl-b si RNA后则细胞凋亡显著升高。以上结果均提示Cbl-b过表达参与了膀胱癌细胞免疫逃逸的发生。进一步通过生物信息学软件分析预测发现Cbl-b是mi R-30c、mi R-135a、mi R-27a的共同的作用位点,接着荧光素酶报告基因实验结果证明Cbl-b是mi R-30c,mi R-135a和mi R-27a的共同靶点。进一步的功能验证实验表明,mi RNA inhibitor组Cbl-b蛋白明显升高,mi R-30c、mi R-135a、mi R-27a inhibitor混合组的Cbl-b蛋白也显著升高。在si Drosha和si Dicer组中,多种mi RNA的表达均明显降低,其中Both-si组显著下降;si Drosha和si Dicer组,Cbl-b蛋白表达均上升,其中Both-si组蛋白表达显著升高。此外,干扰Drosha和Dicer表达后的CD3+/CD4+双阳性增多,其中Both-si组升高最明显,而CD3+/CD8+双阳性明显降低,CD8+/PD-1表达上调,Both-si组降低最明显。干扰Drosha和Dicer表达后细胞因子浓度降低,其中Both-si组升高最明显。这些结果都提示我们干扰Drosha和Dicer表达后促使肿瘤细胞发生免疫逃逸。体内研究:与对照组PBMC相比,干扰组的肿瘤体积以及生长曲线均升高,其中PBMC-si Both组肿瘤体积最大,肿瘤生长曲线最快。细胞因子含量的检测中,与对照组PBMC相比,干扰组的细胞因子IL-2以及TNF-α的含量均降低,其中PBMC-si Both组下降最明显。肿瘤组织的HE染色结果显示,与对照组PBMC相比,干扰组肿瘤组织的炎症浸润明显减少,其中PBMC-si Both组最明显。同样,Tunel染色结果也表明,干扰组肿瘤组织的细胞凋亡明显减少,其中PBMC-si Both组最明显。IHC结果表明干扰组肿瘤组织的CD68阳性表达明显减少。以上结果均表明,在体内下调mi RNA生物合成过程促进了肿瘤免疫逃逸发生。结论:本研究以膀胱癌中广泛分布的外周血单个核细胞PBMC为研究对象,通过分子生物学、细胞生物学和蛋白质组学等手段,探讨低氧条件下mi RNA生成对膀胱癌发展过程中肿瘤细胞免疫逃逸的机制。研究结果表明在低氧条件下,PBMC细胞中Drosha和Dicer的表达下调,并且促进膀胱癌细胞发生免疫逃逸。进一步的机制研究和体内实验发现低氧条件下,PBMC细胞中Drosha和Dicer的表达下调影响mi RNA的生成,促进Cbl-b的表达,从而促进膀胱癌细胞发生免疫逃逸。