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第一部分:脊髓背角BDNF/trkB-KCC2信号通路和大鼠术后持续性痛的关系研究目的:观察大鼠脊髓背角BDNF/trkB-KCC2信号通路的激活是否参与皮肤/肌肉切口牵拉术诱发的术后持续性痛的发生发展。方法:(1)129只雄性SD大鼠(180-230g),将其随机平均分为3组,即为:正常组,假手术组和术后持续性痛组。正常组不做任何处理,手术组采用皮肤/肌肉切口牵拉术(skin/muscle incision and retraction,SMIR)法建立大鼠术后持续性痛模型。假手术组不牵拉皮肤/肌肉组织,其余的操作和术后持续性痛模型一致。于术前1d及术后3,7,12,22,32d测定大鼠机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)(n=8/组),Western印迹法测定每个行为学时间点大鼠脊髓背角BDNF,trkB和KCC2蛋白的表达(每个时间点n=5/组),采用免疫荧光检测术后脊髓背角KCC2的表达变化(n=5/组)。(2)72只雄性SD大鼠(180-230g)随机平均分为4组,即假手术+生理盐水组,假手术+TrkB/Fc组,SMIR+生理盐水组,SMIR+TrkB/Fc组。假手术+生理盐水组和SMIR+生理盐水组大鼠分别在SMIR术前15min和术后第1-3d每天鞘内注射TrkB/Fc溶剂,即生理盐水10μl,假手术+TrkB/Fc组和SMIR+TrkB/Fc组则在相同时间点分别鞘内注射一次BDNF/trkB信号通路抑制剂TrkB/Fc 2μg(溶于10μl 生理盐水)。于术前1d及术后3,7,12,22,32d测定大鼠机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)(n=8/组),Western印迹法测定术后7d大鼠脊髓背角KCC2蛋白的表达(每个时间点n=5/组),免疫荧光检测术后12d脊髓背角KCC2的表达变化(n=5/组)。结果:(1)术后持续性疼痛组大鼠右侧足底机械缩足反射阈值在术后第3-32d时明显下降;脊髓背角BDNF,trkB蛋白表达明显上调,而KCC2蛋白表达明显下调,结果均具有统计学差异(P<0.05)。(2)4组大鼠术前机械缩足反射阈值比较无统计学差异(P>0.05);和接受生理盐水安慰治疗的皮肤/肌肉切口牵拉大鼠相比,TrkB/Fc治疗的皮肤/肌肉切口牵拉大鼠右侧足底机械缩足反射阈值在术后第7-22d时明显上调,但仍然低于接受假手术的两组大鼠;在术后12d,western印迹法和免疫荧光分析显示TrkB/Fc治疗的皮肤/肌肉切口牵拉组大鼠脊髓背角的KCC2表达明显上调,而仍然低于接受假手术组的大鼠。结果均具有统计学差异(P<0.05)。结论:脊髓背角BDNF/trkB-KCC2信号通路的激活可能参与了皮肤/肌肉切口牵拉诱发的术后持续性痛。第二部分:右美托咪定对大鼠术后持续性痛和脊髓背角BDNF/trkB-KCC2信号通路的影响目的:观察腹腔内注射右美托咪定对SMIR诱发的术后持续性痛及对脊髓水平BDNF/trkB-KCC2信号的影响。方法:(1)72只雄性SD大鼠(180-230g)随机平均分为4组:假手术+生理盐水组,假手术+右美组,SMIR+生理盐水组和SMIR+右美组。假手术+右美组和SMIR+右美组分别在SMIR术前15min和术后第1-3d每天腹腔内注射右美托咪定40ug/kg,而假手术+生理盐水组和SMIR+生理盐水组则在相同时间点分别腹腔内注射相同体积的生理盐水。于术前1d及术后1-32d分别测定大鼠机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)(n=8/组),在术前1d和术后3,7,12,22,32d采用Western印迹法测定术后7d大鼠脊髓背角BDNF,trkB和KCC2蛋白的表达(每个时间点n=5/组),采用免疫荧光检测术后12d脊髓背角KCC2的表达变化(n=5/组)。(2)16只雄性SD大鼠(180-230g)随机平均分成2组,即SMIR+右美+DMS0组和SMIR+右美+VU0240551组.两组大鼠均在术前15min和术后1-3d分别腹腔内注射40μg/kg的右美托咪定;同时,SMIR+右美+DMS0组鞘内注射10μl 0.01%DMSO,而SMIR+右美+VU0240551 组鞘内注射0.27μgVU0240551(溶于10μl 0.01%DMSO).于术前1d及术后1-32d分别测定大鼠机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)(n=8/组)。结果:(1)4组大鼠术前MWT比较无统计学差异(P>0.05);与SMIR+生理盐水组相比,SMIR+右美组的机械缩足反射阈值在术后7-22d时明显升高(P<0.05)。western印迹法分析显示,和SMIR+生理盐水组相比,SMIR+右美组大鼠脊髓背角的BDNF和trkB的蛋白表达在术后12d明显下调,而KCC2的表达明显增多。免疫荧光结果也显示脊髓背角KCC2的表达明显上调(P<0.05)。(2)和SMIR+右美+DMSO组相比,SMIR+右美+VU0240551组大鼠的机械缩足反射阈值在术后1-32d明显下降(P<0.05)。结论:右美托咪定能够明显缓解大鼠皮肤/肌肉切口牵拉诱发的术后持续性痛,而这一作用可能和其对脊髓水平BDNF/trkB-KCC2信号的调节有关。