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核酸内切酶tRNase Z,能促进tRNA3末端加工成熟,这个过程是tRNA3-CCA的添加以及后续tRNA氨基酰化所必须的。在不同的生物中tRNase Z的数量和类型不同。人中有两个,一个是长型(ELAC2)和一个短型的(ELAC1)。芽殖酵母(Schizosaccharomyces cerevisiae)只有一个tRNase Z基因(scTRZ1,YKR079c),其编码的蛋白定位于细胞核和线粒体中。粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe中含有两种tRNase Z基因:sptrz1+(SPAC1D4.10)和sptrz2+(SPBC3D6.03c),它们编码的蛋白分别定位于细胞核和线粒体中,我采用绿色荧光蛋白和线粒体染料跟踪SpTrz2p发现N端38个氨基酸是SpTrz2p的线粒体信号序列。
本实验组已经发现两种sptrz2+是必需基因,低表达野生型sptrz2+能互补sptrz2+的缺失菌株,但是sptrz2+表达量过高时会导致菌体死亡。我们使用随机孢子分析法和质粒穿梭实验发现SpTrz2p的N端Flag标签和C端Flag标签都会影响SpTrz2p的生物学功能,并且在低表达时,N端Flag标签对SpTrz2p体内功能影响的更大,C端添加5个Flag标签影响相对较小。体内实验证明了SpTrz2p、芽殖酵母的ScTRZ1p和人的ELAC2在裂殖酵母中具有核内tRNA前体3末端加工酶活性,但是质粒互补实验发现ELAC2和ScTRZ1p都不能替代SpTrz2p缺失,即使在ELAC2和ScTRZ1p前添加SpTrz2p的线粒体信号肽也不能替代SpTrz2p,这些实验都表明在体内SpTrz1p,SpTrz2p、ScTRZ1p和ELAC2有功能上的差异。为了进一步研究SpTrz2p的功能我们采用易错PCR法随机突变sptrz2+并置换基因组上的野生型sptrz2+基因构建sptrz2+的温度敏感型突变体,并筛选出了一株温度敏感型突变体YY-TS,但是该突变体不能被外源表达SpTrz2p救活。后来发现sptrz2+的A623V的突变会产生温度敏感的表型,但是温度敏感型菌D113的生长依赖于SpTrz2p的正常表达。因此在后续实验中我们将使用定点突变的方法来获得yHL6381遗传背景下的sptrz2+的A623V突变,期待得到温度敏感型菌,然后利用温度敏感型菌来研究不同物种中tRNase Z的保守性。