畜禽粪便造成了地表水体普遍存在微生物污染,及时有效地针对源头控制是解决问题的关键。近年来,欧美等发达国家开展了利用微生物进行水体粪便污染溯源的研究工作,发展了微生物源示踪(Microbial Source Tracking,MST)技术(又称微生物溯源技术),此技术为污染来源的快速识别提供新的思路,但是存在特异性生物标记种类单一和地域性差异的局限。针对这一问题,本项目选取珠江三角洲地区为目标研究区域,采用微生物溯源的方法,通过广泛采集动物粪便样本,选取特异性拟杆菌引物,以在不同宿主粪便样本中提取到的基因组DNA为模板进行扩增,验证具有宿主特征的特异性引物。并根据所确定的特异性生物标记分析和确定珠江三角洲地区水域的主要污染源。通过对来自广州市白云区、萝岗区、越秀区,清远市和惠州市共135个粪便样本和8份水体样本的研究,确定了拟杆菌通用引物Bac32F/Bac708R,人的拟杆菌生物标记的特异性引物HF134F/Bac708R以及HF183/Bac708R,猪的拟杆菌生物标记的特异性引物PF163F/Bac708R和鸡的拟杆菌生物标记的特异性引物CBR2-42F/CBR2-42R在珠三角地区具有较好的特异性。采用这些特异性引物对已知污染源的水体进行分析验证,为珠江三角洲地区地表水微生物污染溯源提供依据。针对生物标记在环境中持续衰减的特性,本文建立了用于定量研究的鸡的拟杆菌特异性引物qC160F-HU/qBac265R-HU,拟杆菌通用引物GenBac3F/GenBac3R;总细菌引物BACT1369F/PROK1541R和大肠杆菌通用引物EC23S857F/EC23S857R四类特征引物的标准曲线。确定其在珠三角地区具有较好的特异性。本实验摸索并建立了水环境模拟系统,通过控制单一变量溶氧值,研究分析微生物指标和环境指标在好氧环境和厌氧环境中变化规律的区别和联系。在水环境模拟系统运行期间,好氧环境水体浊度由6.69NTU下降至3.36NTU,COD由38.5mg/L下降至15mg/L;厌氧环境水体浊度由7.18NTU上升至9.23NTU,COD由42mg/L下降至40mg/L,证明好氧环境的水体自净能力高于厌氧环境。同时,对于水环境模拟系统微生物指标的检测结果显示,实验初始状态下,拟杆菌通用引物C1,大肠杆菌通用引物E1和鸡的拟杆菌特异性引物B11所能扩增的片段拷贝数数量级分别高达109,108和107。说明鸡粪中拟杆菌含量高于大肠杆菌含量,同时,并非鸡粪便内的所有拟杆菌都具备鸡的拟杆菌特异性生物标记,鸡的肠道环境仅对部分拟杆菌菌株基因产生定向影响。根据拟杆菌通用引物C1在好氧环境和厌氧环境后期衰减速率接近,厌氧环境下鸡的拟杆菌特异性引物B11,拟杆菌通用引物C1和大肠杆菌通用引物E1的片段扩增拷贝数在第六天出现明显的下降,结合厌氧环境下第六天氨氮值明显跃升的现象。推断出拟杆菌和大肠杆菌在厌氧水环境中存在存活和死亡两个阶段,不同阶段的生物标记衰减情况不同。并提出在生物标记衰减研究中应引入菌体活性检测技术。