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研究目的:探讨Pin1在黑色素瘤干细胞中的作用及Pin1靶向药物治疗的潜在作用,为黑色素瘤的治疗提供实验基础和开拓新的思路。研究方法:1.通过包装PIN1 shRNA慢病毒、感染黑色素瘤细胞及药物筛选,获得稳定敲减Pin1基因的黑色素瘤细胞株。用Western Blot和流式细胞术探索敲减黑色素瘤细胞Pin1基因后干细胞标志物的表达水平。2.敲减黑色素瘤细胞Pin1基因,利用软琼脂克隆形成实验探索黑色素瘤细胞克隆增殖和采用黑色素瘤干细胞微球形成方法探讨干细胞微球形成能力。3.在裸鼠后翼一侧皮下注射1*10^6个敲减Pin1基因的黑色素瘤细胞,另一侧注射同数量的对照细胞,探讨敲减Pin1基因的黑色素瘤细胞裸鼠体内致瘤性。4.敲减Pin1基因的黑色素瘤细胞梯度稀释行裸鼠皮下成瘤实验探讨黑色素瘤干细胞的致瘤性。5.裸鼠随机分为实验组和对照组,实验组裸鼠尾静脉注射2*10^6个敲减Pin1基因的黑色素瘤细胞,对照组注射同数量的对照细胞,探讨黑色素瘤细胞Pin1基因敲减后裸鼠肺部转移能力。6.黑色素瘤细胞注射裸鼠皮下,成瘤后随机分组,单药处理分2组,联合用药处理分4组,用Pin1抑制剂ATRA或联合Vemurafenib用药处理裸鼠,探讨Pin1抑制剂ATRA对黑色素瘤的治疗作用以及探讨联合Vemurafenib治疗黑色素瘤的研究。7.用免疫组织化学染色方法检测人临床样本和黑色素瘤组织芯片中Pin1蛋白的表达程度。研究结果:1.Western Blot显示与黑色素瘤细胞干性标志物NANOG在Pin1基因敲减后下调,分化相关标志物MITF在Pin1基因敲减后上调。2.流式细胞术显示Pin1基因敲减后下调黑色素瘤干细胞相关的标志物CD271和ALDH1表达。3.软琼脂克隆形成实验显示黑色素瘤细胞克隆增殖能力在敲减Pin1基因后降低;黑色素瘤干细胞微球形成实验显示相比对照组,敲减Pin1基因的黑色素瘤细胞微球数少且体积小。4.裸鼠皮下异种移植黑色素瘤细胞的肿瘤生长和裸鼠尾静脉注射黑色素瘤细胞的肺部转移能力在黑色素瘤细胞敲减Pin1基因后受到抑制。5.黑色素瘤细胞敲减Pin1基因后梯度稀释裸鼠皮下成瘤实验显示在1*10^3、1*10^4、1*10^5个细胞梯度中没有观察到肿瘤的形成。6.ATRA单药处理裸鼠皮下黑色素瘤细胞荷瘤,实验显示与对照组相比,Pin1抑制剂ATRA单药能抑制裸鼠皮下肿瘤的生长。7.免疫组织化学染色人临床样本和黑色素瘤组织芯片显示156例病人中有22例高表达(+++),43例中表达(++),46例低表达(+),45例不表达(-)。结论:我们研究的结果显示有14.1%黑色素瘤病人肿瘤组织高表达Pin1。在黑色素瘤细胞中敲减Pin1基因后细胞克隆增殖降低,与干性或分化相关的标志物表达异常,黑色素瘤干细胞标志物及干细胞微球形成能力均下调。裸鼠黑色素瘤细胞的肿瘤生长和肺部转移的能力均在黑色素瘤细胞Pin1基因敲减后得到抑制。Pin1抑制剂ATRA能够抑制裸鼠皮下黑色素瘤细胞的肿瘤生长。因此,我们认为Pin1通过调控黑色素瘤干细胞而促进黑色素瘤发展,其抑制剂的应用有可能为临床上治疗黑色素瘤提供一个新的思路。