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谷氨酰胺合成酶(GS)广泛存在于动物、植物和微生物体内,能够利用ATP提供的能量催化合成谷氨酰胺,与生物的氮代谢密切相关。此外,研究中发现部分GS也能催化乙胺和谷氨酸生成茶氨酸。谷氨酰胺有很好的营养价值和药用价值,茶氨酸是很好的保健品,这两种化合物均有巨大的市场,所以GS有很好的工业应用潜力。因此,研究针对本室筛选的拥有GS活性的巨大芽孢杆菌N6展开了工作,取得了以下结果:根据巨大芽孢杆菌相关基因组信息设计引物,经PCR扩增得到目的基因BGS。测序得知BGS有1335bp,共有氨基酸444个,分子量约为50.4kDa。经比对与枯草芽孢杆菌的GS的相似性最高(88%)。纯化产物酶学性质检测表明,最适反应温度为30℃,最适反应pH为7.0。该酶在55℃的条件下保温2.5h后,BGS仍有高达90%的活性,在65℃条件下保温1h后,仍有50%的活性。通过薄层层析和HPLC验证该酶具有合成茶氨酸的活性。为了改良BGS的酶学性质,利用随机突变和定点突变技术对该基因进行体外定向进化。通过易错PCR构建了随机突变文库,从8000个转化子中筛选获得了2个突变株:F1-D10(D198G)、F1-F10(I28T、L159I)。经测定,F1-D10对ADP的催化效率提高了33%,对谷氨酰胺的催化效率下降了20%,对盐酸羟胺的催化效率提高了79%;F1-F10对ADP的催化效率提高了65.7倍,对谷氨酰胺的催化效率提高了56%,对盐酸羟胺的催化效率提高了67%。对F1-F10进行回复突变,构建了I28T和L159I,其中L159I对ADP、谷氨酰胺、盐酸羟胺的催化效率分别提高了93.7倍,2.5倍和3.2倍。通过多序列比对和同源建模方法选取了7个距离活性中心比较近的位点进行了定点突变。结果表明,E65A与野生型相比对ADP、谷氨酰胺、盐酸羟胺的催化效率分别提高了154.7倍、1.4倍和2倍。为了探讨不同突变位点是否存在叠合效果,构建了E65A/D198G,结果并未产生叠加效应。对E65A,L159I酶学性质研究表明,与野生型相比E65A的最适温度由30℃变为50℃,L159I的最适温度变为55℃。同时,L159I的热稳定性得到了显著提升,在65℃水浴2.5h后还有90%的活性,而野生型在相同的条件下仅剩15%。在合成茶氨酸方面,L159I较野生型产量提高了35%。结构模拟的结果显示,L159I的159位的Leu变为Ile,使得两个单体之间的空间位阻变小,附近氢键结合更紧密。65位的Glu变为Ala不仅使催化位点更容易暴露而且使活性空腔开口变大,反应底物更易进入。总之,本研究为BGS的结构与功能研究及进一步研发奠定了基础。