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背景与目的：
骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨退变及关节周围骨赘形成软骨下骨硬化为基本病理改变的一种关节退行性疾病。其发病机制尚不完全清楚。OA在肥胖患者中多见。传统观点认为因肥胖导致关节负荷增加导致了软骨的退变，但是这无法解释非负重关节发生的OA。越来越多的研究更倾向于认为它是由于体内免疫紊乱、内分泌及代谢失衡等原因引起。瘦素(Leptin)是白色脂肪细胞分泌的一种肽类激素，在肥胖患者中分泌明显增多，有研究发现在OA患者关节液中存在Leptin的高表达。有研究表明Leptin在体内广泛的参与了免疫及体内物质代谢的调节过程。Leptin在肥胖患者的OA发生中或许起到了重要作用。
实验通过采集OA患者及类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis， RA)患者关节软骨标本，检测Leptin及相关炎症因子的表达，分析其与OA的相关性；通过体外实验研究Leptin对软骨细胞生长、增殖及分泌表达的影响，论证Leptin在关节软骨退变中的作用；通过研究Leptin对破骨细胞前体细胞的影响，进一步了解Leptin在肥胖性OA患者关节骨代谢平衡失调方面的作用，以阐释肥胖性OA关节中的骨赘形成及软骨下骨硬化的机制。
方法：
1.通过收集临床上OA患者及RA患者的膝关节软骨标本，病人按照患者的BMI值、中华医学会颁布的《骨关节炎诊疗指南》以及美国风湿协会诊断标准被分为三组，第一组：诊断为OA，BMI值大于等于28Kg/m2(肥胖性OA组)；第二组，诊断为OA，但是BMI值小于28Kg/m2(非肥胖性OA组)；第三组，诊断为RA组。标本一部分做HE染色和免疫组化，检测标本中Leptin、SOCS3、Sirt1、MMP-13、COL2、LC3表达情况，利用ImageJ软件分析其表达差异。另一部分进行qRT-PCR和WesternBlot检测Leptin、SOCS3、Sirt1、MMP-13、COL2、LC3在基因和蛋白水平上的表达情况，利用Quantityone软件分析其表达差异。
2.利用胰蛋白酶和II型胶原酶双酶消化法提取、分离并培养软骨细胞。细胞分为三组。第一组：加入完全培养基培养，第二组：完全培养基+50ng/mlLeptin，第三组：完全培养基+100ng/mlLeptin。显微镜观察不同浓度的Leptin对软骨细胞生长的影响。利用qRT-PCR和WesternBlot法检测三组细胞培养7天后的Sirt1、LC3、MMP-13、COL2、SOCS3基因及蛋白表达情况。
3.收集肥胖OA患者及正常人(外伤导致关节内骨折)的软骨标本，并分离、提取和培养软骨细胞，qRT-PCR检测软骨组织和软骨细胞中的LncRNAPART1的表达，及Leptin对PART1表达的影响，利用RNA干扰技术检测PART1对软骨细胞增殖、凋亡及对软骨基质降解的影响。通过在线数据库starBase2.0发现PART1的靶基因miR-373-3p，并通过双荧光素酶及RNA免疫沉淀实验证实。OA软骨细胞分为三组，分别转染si-NC、si-PART1#1和si-PART1#1+anti-miR-373-3p，检测三组细胞的生存率，并检测Bcl-2、Bax和Cleaved-cas-3的表达，以及MMP-13、COL2和Aggrecan的表达。通过在线数据库starBase2.0发现miR-373-3p的靶基因是SOX4，并通过双荧光素酶及RNA免疫沉淀实验证实。为了证明miR-373-3p对SOX4的作用，软骨细胞被分为两组，分别转染miR-NC和miR-373-3p，并检测两组细胞SOX4基因和蛋白的表达。为了进一步研究SOX4与miR-373-3p和PART1之间的关系，软骨细胞被分为四组，分别转染si-NC、si-PART1#1、si-PART1#1+anti-miR-373-3p和si-PART1#1+pcDNA-SOX4，并检测Bcl-2、Bax和Cleaved-cas-3的表达，以及MMP-13、COL2和Aggrecan的表达。
4.加入50ng/ml的核因子-κB受体活化因子配体(ReceptoractivatorofNuclearfactor-κBligand，RANKL)诱导破骨细胞前体细胞RAW264.7向破骨细胞分化，同时分别利用0ng/mlLeptin、50ng/mlLeptin和100ng/mlLeptin干预RAW264.7；通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色检测通过RANKL诱导后的RAW264.7细胞向破骨细胞分化情况；分别利用qRT-PCR和WesternBlot检测TRAP、CTSK、c-jun及c-fos的mRNA和蛋白表达情况。
5.各项数据均使用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料用mean±SD表示，两组间的比较采用配对t检验，多组间比较用单因素方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义，P≥0.05差异无统计学意义。
结果：
1.共收集符合要求的病例42例。肥胖性OA组20例，非肥胖性OA组10例，RA组12例。与非肥胖性OA患者及RA患者相比，在肥胖性OA患者的关节软骨中有更高的Leptin和MMP-13表达(p＜0.05)；更低的SOCS3表达(p＜0.05)。但是三组患者的Sirt1、LC3和COL2表达无显著性差异(p＞0.05)。
2.通过双酶消化法成功分离提取出软骨细胞；当不同浓度的Leptin作用于软骨细胞，软骨细胞的生长受到抑制，细胞活性降低，自噬相关基因Sirt1、LC3的表达明显降低(p＜0.05)；与未干预组相比，加入50和100ngLeptin组的软骨细胞分泌的COL2明显减少(p＜0.05)，但是MMP-13的表达升高较明显(p＜0.05)；与未干预组相比，加入50ngLeptin组的软骨细胞SOCS3基因及蛋白表达上调(p＜0.05)，而加入100ng组表达下调(p＜0.05)。
3.与正常软骨细胞相比，在肥胖患者OA软骨细胞中检测到了更多的PART1的表达，Leptin进一步促进了PART1的表达，抑制miR-373-3p的表达；当抑制PART1后，miR-373-3p表达增加，细胞的抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降，凋亡相关蛋白Bax及Cleaved-cas-3上升，细胞凋亡率增加，同时抑制MMP-13的表达，促进COL2和Aggrecan的表达，而这种作用能被anti-miR-373-3p逆转。与正常软骨细胞相比，在OA软骨细胞中SOX4的表达明显增加，miR-373-3p的上调降低了SOX4的水平，通过抑制PART1能抑制SOX4表达，当加入anti-miR-373-3p或者pcDNA-SOX4后SOX4的表达恢复。SOX4能逆转因PART1下调导致的细胞凋亡率增加，和MMP-13的表达下降，以及COL2和Aggrecan的表达上升。
4.RANKL作用于破骨细胞前体细胞RAW264.7后，细胞的TRAP染色呈阳性，细胞核呈现多核样改变，而同时加入Leptin组的细胞多核样改变的数偏少；通过qRT-PCR和WesternBlot检测TRAP和CTSK的基因和蛋白表达，发现在加入了Leptin组的细胞明显比未加Leptin组少(p＜0.05)；同时，加入了Leptin组的细胞，c-jun的基因及蛋白表达明显升高(p＜0.05)；c-fos的基因及蛋白表达明显降低(p＜0.05)。
结论：
1.在肥胖性OA患者的关节软骨中Leptin无论是在基因水平还是蛋白水平均存在高表达；Leptin水平与患者的BMI指数呈正相关。
2.Leptin通过降低Sirt1表达，抑制自噬相关基因LC3的表达，调节软骨细胞自噬水平，影响软骨细胞生长及活性；同时通过促进软骨细胞MMP-13的表达，抑制COL2的表达，破坏软骨基质，影响软骨再生；高浓度的Leptin抑制了SOCS3的表达，降低了SOCS3对Leptin引起的炎症反应的抑制作用，从而使关节内局部免疫调节机制失衡，进一步加重了肥胖患者OA的进程。
3.Leptin通过LncRNAPART1、SOX4、miR-373-3p调控网络，影响软骨细胞凋亡，影响软骨细胞活性，抑制COL2和Aggrecan的表达，促进MMP-13的表达，促进软基质降解。
4.Leptin通过NF-κB通道和JNK信号通道抑制破骨细胞前体细胞向破骨细胞的分化，影响了关节内的骨代谢平衡，这有可能是导致OA患者关节中骨赘形成及软骨下骨硬化的原因。
骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨退变及关节周围骨赘形成软骨下骨硬化为基本病理改变的一种关节退行性疾病。其发病机制尚不完全清楚。OA在肥胖患者中多见。传统观点认为因肥胖导致关节负荷增加导致了软骨的退变，但是这无法解释非负重关节发生的OA。越来越多的研究更倾向于认为它是由于体内免疫紊乱、内分泌及代谢失衡等原因引起。瘦素(Leptin)是白色脂肪细胞分泌的一种肽类激素，在肥胖患者中分泌明显增多，有研究发现在OA患者关节液中存在Leptin的高表达。有研究表明Leptin在体内广泛的参与了免疫及体内物质代谢的调节过程。Leptin在肥胖患者的OA发生中或许起到了重要作用。
实验通过采集OA患者及类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis， RA)患者关节软骨标本，检测Leptin及相关炎症因子的表达，分析其与OA的相关性；通过体外实验研究Leptin对软骨细胞生长、增殖及分泌表达的影响，论证Leptin在关节软骨退变中的作用；通过研究Leptin对破骨细胞前体细胞的影响，进一步了解Leptin在肥胖性OA患者关节骨代谢平衡失调方面的作用，以阐释肥胖性OA关节中的骨赘形成及软骨下骨硬化的机制。
方法：
1.通过收集临床上OA患者及RA患者的膝关节软骨标本，病人按照患者的BMI值、中华医学会颁布的《骨关节炎诊疗指南》以及美国风湿协会诊断标准被分为三组，第一组：诊断为OA，BMI值大于等于28Kg/m2(肥胖性OA组)；第二组，诊断为OA，但是BMI值小于28Kg/m2(非肥胖性OA组)；第三组，诊断为RA组。标本一部分做HE染色和免疫组化，检测标本中Leptin、SOCS3、Sirt1、MMP-13、COL2、LC3表达情况，利用ImageJ软件分析其表达差异。另一部分进行qRT-PCR和WesternBlot检测Leptin、SOCS3、Sirt1、MMP-13、COL2、LC3在基因和蛋白水平上的表达情况，利用Quantityone软件分析其表达差异。
2.利用胰蛋白酶和II型胶原酶双酶消化法提取、分离并培养软骨细胞。细胞分为三组。第一组：加入完全培养基培养，第二组：完全培养基+50ng/mlLeptin，第三组：完全培养基+100ng/mlLeptin。显微镜观察不同浓度的Leptin对软骨细胞生长的影响。利用qRT-PCR和WesternBlot法检测三组细胞培养7天后的Sirt1、LC3、MMP-13、COL2、SOCS3基因及蛋白表达情况。
3.收集肥胖OA患者及正常人(外伤导致关节内骨折)的软骨标本，并分离、提取和培养软骨细胞，qRT-PCR检测软骨组织和软骨细胞中的LncRNAPART1的表达，及Leptin对PART1表达的影响，利用RNA干扰技术检测PART1对软骨细胞增殖、凋亡及对软骨基质降解的影响。通过在线数据库starBase2.0发现PART1的靶基因miR-373-3p，并通过双荧光素酶及RNA免疫沉淀实验证实。OA软骨细胞分为三组，分别转染si-NC、si-PART1#1和si-PART1#1+anti-miR-373-3p，检测三组细胞的生存率，并检测Bcl-2、Bax和Cleaved-cas-3的表达，以及MMP-13、COL2和Aggrecan的表达。通过在线数据库starBase2.0发现miR-373-3p的靶基因是SOX4，并通过双荧光素酶及RNA免疫沉淀实验证实。为了证明miR-373-3p对SOX4的作用，软骨细胞被分为两组，分别转染miR-NC和miR-373-3p，并检测两组细胞SOX4基因和蛋白的表达。为了进一步研究SOX4与miR-373-3p和PART1之间的关系，软骨细胞被分为四组，分别转染si-NC、si-PART1#1、si-PART1#1+anti-miR-373-3p和si-PART1#1+pcDNA-SOX4，并检测Bcl-2、Bax和Cleaved-cas-3的表达，以及MMP-13、COL2和Aggrecan的表达。
4.加入50ng/ml的核因子-κB受体活化因子配体(ReceptoractivatorofNuclearfactor-κBligand，RANKL)诱导破骨细胞前体细胞RAW264.7向破骨细胞分化，同时分别利用0ng/mlLeptin、50ng/mlLeptin和100ng/mlLeptin干预RAW264.7；通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色检测通过RANKL诱导后的RAW264.7细胞向破骨细胞分化情况；分别利用qRT-PCR和WesternBlot检测TRAP、CTSK、c-jun及c-fos的mRNA和蛋白表达情况。
5.各项数据均使用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料用mean±SD表示，两组间的比较采用配对t检验，多组间比较用单因素方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义，P≥0.05差异无统计学意义。
结果：
1.共收集符合要求的病例42例。肥胖性OA组20例，非肥胖性OA组10例，RA组12例。与非肥胖性OA患者及RA患者相比，在肥胖性OA患者的关节软骨中有更高的Leptin和MMP-13表达(p＜0.05)；更低的SOCS3表达(p＜0.05)。但是三组患者的Sirt1、LC3和COL2表达无显著性差异(p＞0.05)。
2.通过双酶消化法成功分离提取出软骨细胞；当不同浓度的Leptin作用于软骨细胞，软骨细胞的生长受到抑制，细胞活性降低，自噬相关基因Sirt1、LC3的表达明显降低(p＜0.05)；与未干预组相比，加入50和100ngLeptin组的软骨细胞分泌的COL2明显减少(p＜0.05)，但是MMP-13的表达升高较明显(p＜0.05)；与未干预组相比，加入50ngLeptin组的软骨细胞SOCS3基因及蛋白表达上调(p＜0.05)，而加入100ng组表达下调(p＜0.05)。
3.与正常软骨细胞相比，在肥胖患者OA软骨细胞中检测到了更多的PART1的表达，Leptin进一步促进了PART1的表达，抑制miR-373-3p的表达；当抑制PART1后，miR-373-3p表达增加，细胞的抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降，凋亡相关蛋白Bax及Cleaved-cas-3上升，细胞凋亡率增加，同时抑制MMP-13的表达，促进COL2和Aggrecan的表达，而这种作用能被anti-miR-373-3p逆转。与正常软骨细胞相比，在OA软骨细胞中SOX4的表达明显增加，miR-373-3p的上调降低了SOX4的水平，通过抑制PART1能抑制SOX4表达，当加入anti-miR-373-3p或者pcDNA-SOX4后SOX4的表达恢复。SOX4能逆转因PART1下调导致的细胞凋亡率增加，和MMP-13的表达下降，以及COL2和Aggrecan的表达上升。
4.RANKL作用于破骨细胞前体细胞RAW264.7后，细胞的TRAP染色呈阳性，细胞核呈现多核样改变，而同时加入Leptin组的细胞多核样改变的数偏少；通过qRT-PCR和WesternBlot检测TRAP和CTSK的基因和蛋白表达，发现在加入了Leptin组的细胞明显比未加Leptin组少(p＜0.05)；同时，加入了Leptin组的细胞，c-jun的基因及蛋白表达明显升高(p＜0.05)；c-fos的基因及蛋白表达明显降低(p＜0.05)。
结论：
1.在肥胖性OA患者的关节软骨中Leptin无论是在基因水平还是蛋白水平均存在高表达；Leptin水平与患者的BMI指数呈正相关。
2.Leptin通过降低Sirt1表达，抑制自噬相关基因LC3的表达，调节软骨细胞自噬水平，影响软骨细胞生长及活性；同时通过促进软骨细胞MMP-13的表达，抑制COL2的表达，破坏软骨基质，影响软骨再生；高浓度的Leptin抑制了SOCS3的表达，降低了SOCS3对Leptin引起的炎症反应的抑制作用，从而使关节内局部免疫调节机制失衡，进一步加重了肥胖患者OA的进程。
3.Leptin通过LncRNAPART1、SOX4、miR-373-3p调控网络，影响软骨细胞凋亡，影响软骨细胞活性，抑制COL2和Aggrecan的表达，促进MMP-13的表达，促进软基质降解。
4.Leptin通过NF-κB通道和JNK信号通道抑制破骨细胞前体细胞向破骨细胞的分化，影响了关节内的骨代谢平衡，这有可能是导致OA患者关节中骨赘形成及软骨下骨硬化的原因。