一、研究背景和目的登革病毒病流行于热带和亚热带地区,最近几十年发病率在全球大幅度上升。占世界人口40%以上的约25亿人面临罹患登革的危险。世卫组织估计,每年世界上可能有5000万至1亿登革病毒感染病例,是分布最广、发病人数最多、危害较大的一种虫媒病毒性疾病。2014年12月广东卫生和计划生育委员会报告全年登革热病例约45000多人,且出现了不少重症登革的病例,因尚无有效药物和疫苗,只能对症治疗,致使死亡率高。因此,登革病毒病已成为全球性的公共卫生问题,控制病毒感染刻不容缓。重症登革的致病机理迄今尚未阐明,抗体依赖性感染增强作用(antibody dependent enhancement; ADE)在登革病毒致病机理、免疫学和疫苗学研究中占据统治地位,这一理论认为表面具有Fc受体的单核吞噬细胞系统是登革病毒的主要靶细胞,登革病毒与其特异抗体形成复合物,再通过抗体的Fc段与单核吞噬细胞表面的FC受体结合,进入细胞并复制,从而导致病毒载量增加。登革病毒在增殖过程中能够同时产生成熟颗粒和未成熟颗粒。prM抗体介导ADE效应的作用机制主要与未成熟病毒颗粒有关。电镜及功能学研究表明,未成熟病毒颗粒的表面突起由prM-E蛋白异源二聚体构成,prM蛋白在空间上封闭了E蛋白的融合肽,从而使未成熟病毒颗粒无法启动膜融合过程。prM蛋白经宿主弗林蛋白酶切割后可释放其N端pr肽,启动未成熟病毒颗粒的结构重排,诱导prM-E异源二聚体的解聚,促使E蛋白首尾相连形成同源二聚体平铺于圆滑的颗粒表面,完成病毒颗粒的成熟过程。因此,正常条件下只有成熟颗粒具有感染性,未成熟病毒颗粒不具感染性；在prM抗体存在的条件下,prM抗体能够与未成熟病毒颗粒表面的prM蛋白特异结合,通过Fc受体或热休克蛋白介导的方式感染宿主细胞,使未成熟病毒颗粒获得感染能力,进而表现为ADE的作用。prM抗体与未成熟病毒颗粒的相互作用的发现极大地加深了对登革病毒ADE机制的理解。大部分登革病毒感染的靶细胞包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等,同时表达活化性受体和抑制性受体,最近研究表明,FcγRⅡa、FcγRⅠa等活化性受体对ADE效应起促进作用,而对FcγRⅡb在登革病毒ADE上研究甚少。FcγRⅡb作为一种抑制性受体,可介导对多种免疫细胞的负反馈调节反应。Fc γRllb的胞内区含有免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptortyrosine-based inhibition motif, ITIM),主要介导负反馈调节效应。当与含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)的活化性受体交联时,Fc γRⅡb主要通过依赖ITIM的方式参与信号传导,维持外周免疫耐受的平衡。Fc γRⅡb作为多种白细胞表面的唯- FcγR抑制性受体,其参与细胞的免疫调节功能正受到日益关注。活化型Fc受体FcγR I和FcγR Ⅱa已被证明可以促进登革热病毒在人巨噬细胞中的感染,但抑制型受体Fc γ RⅡb对ADE作用的影响研究甚少,Fc受体对ADE的作用机制尚未明确,特别是抑制性受体对ADE作用,以及共表达活化性受体和抑制性受体时,两种受体间的关系及对ADE作用还有待阐明。近来有文献报道,Fc γ RⅡb对ADE起抑制性作用,然而其产生抑制性作用的确切机理非常值得探究。例如,是否由于Fc γ RⅡb中免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)直接抑制活化性受体中免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM),从而产生抑制性作用?还是在免疫复合物与受体结合后,诱导了不同的细胞通路?还是Fc γRⅡb与Fc γRⅡa竞争有限的免疫复合物?免疫复合物通过Fc γRⅡb和FcγRⅡa的信号转导,从而引起抑制性或活化性作用,为探究ADE机理提供了新的思路。此外,抗体中和登革病毒除了通过抑制病毒与靶细胞结合或者融合两种机制外,最近有研究指出,还有一种中和机制是体积较大的抗原抗体复合物通过与Fc γRⅡb受体交联,抑制单核巨噬细胞吞噬免疫复合物。作者认为Fc γ RⅡB的抑制性作用可用于解释DV感染后四个血清型短暂的交叉保护。在DV感染后的短期内,体内存在大量抗体,若此时再度感染DV,即可形成体积较大的免疫复合物,体积大的免疫复合物更容易与FcγRⅡB交联,从而抑制细胞内吞病毒。随着时间推移,体内DV抗体逐渐减少,此时再度感染DV,便难以形成较大体积的免疫复合物,相对不易于与发挥抑制作用的FcγRⅡB交联,从而与其他Fc受体介导交联ADE作用。然而,登革病毒的大部分靶细胞表面同时具有抑制性受体与活化性受体,因此两者交联后的作用才适用于探讨ADE以及中和作用的相关机制。本研究通过制备1型登革病毒prM抗体,和DV2病毒结合形成免疫复合物后,感染分别表达FcγRⅡa FcRⅡb以及共表达FcγRⅡa和FcγRⅡb的BHK-21细胞,初步探索FcγRⅡb对ADE的作用。二、研究方法1.1型登革病毒prM蛋白的制备与纯化提取1型登革病毒总RNA, RT-PCR扩增含prM全基因(498 bp)的cDNA片段,将其插入PMD-18T克隆质粒和PGEX-4T-2表达质粒中,转染大肠杆菌BL-21(?)E3)菌后,用终浓度为0.5 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,18℃过夜表达,其表达产物使用谷光甘肽琼脂糖凝胶层析纯化,经SDS-PAGE电泳鉴定纯度,获得纯化后蛋白作为包被抗原。2.prM多克隆抗体的制备与鉴定将纯化后prM蛋白免疫新西兰大白兔,选取效价最高的兔血清,间接ELISA检测兔血清以及纯化后多抗效价,Western-blot鉴定多克隆抗体特异性,SDS-PAGE电泳鉴定纯化效果。3.prM单克隆抗体的制备与鉴定将纯化后prM蛋白免疫BALB/c小鼠,取效价高的小鼠脾细胞,与对数生长的骨髓瘤细胞NS-1进行细胞融合。经HT、HAT选择培养基选择培养后,有限稀释法进行单一杂交瘤细胞系筛选。对阳性单一杂交瘤细胞株进行扩大化培养,制备小鼠腹水,纯化单克隆抗体。间接ELISA检测鼠腹水和纯化后单抗效价,Western-blot检测特异性,SDS-PAGE电泳鉴定纯化效果。4.FcγRⅡa和FcγRⅡb真核表达质粒构建设计引物,分别扩增FcγRⅡa和FcγRⅡb,双酶切Not I/EcoR I后,分别构建入pcDNA3.1(-)以及先后构建入pIRES中,挑单克隆鉴定,测序正确后,获得单独表达FcγRIIa, FcγRIIb和共表达两者的真核表达质粒。5.表达不同FcR BHK-21细胞的制备与鉴定三组重组表达质粒分别使用lip-2000瞬时转染BHK-21细胞,分别为BHK-CD32a, BHK-CD32b, BHK-CD32a+b细胞,48h后流式细胞术检测三种细胞表面表达Fc受体情况。6.prM抗体与登革病毒结合,感染表达不同受体的BHK-21细胞BCA法定量纯化后的prM多抗,蚀斑实验检测DENV-2滴度,取100ug/ml prM多抗与MOI=1的DENV-237℃孵育2h,免疫复合物感染上述表达不同受体的BHK-21细胞,16h后流式细胞术检测细胞内病毒感染率。三、结果1.利用PGEX-4T-2原核表达载体成功的构建了含DENV-1的prM重组表达质粒,IPTG诱导并获得大量可溶性蛋白,纯化后的prM蛋白免疫新西兰大白兔,制备prM多抗,间接ELISA检测兔血清和纯化多抗效价分别为1：10万,1：20万,Western Blot检测prM多抗特异性好。2.纯化后prM蛋白免疫小鼠,制备prM单克隆抗体,间接ELISA检测鼠腹水和纯化后单抗其效价为1：80万,1：40万,Western Blot检测prM单抗特异性好,SDS-PAGE结果显示单抗纯化效果好。3.扩增人源性FcγRⅡa和Feγ RⅡb,成功构建出三种重组真核表达质粒,分别为单独表达FcγRⅡa的pcDNA3.1 (-)-CD32a,单独表达Fc γ RⅡb的pcDNA3.1(-)-CD32b以及共表达FcγRⅡa和Fc γRⅡb的IRES-CD32a+b载体。4.使用lip2000对三种重组真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,流式细胞术结果显示BHK-CD32a, BHK-CD32b以及BHK-CD32a+b表达FcγRⅡa, Feγ RⅡb以及共表达两者的细胞均约为50%,大致统一了受体表达量,为后续评价FcR在ADE中影响作用奠定基础。5.蚀斑试验检钡IDENV-2病毒滴度,病毒原液约为2x107PFU/ml。 BCA法测prM多抗蛋白浓度,约为l0mg/m1。制备免疫复合物后感染THP-1人单核细胞,48h后流式细胞术检测病毒量,prM多抗在较大的抗体稀释度范围内能增加对THP-1细胞的感染,在prM多抗稀释500倍时,感染率达到峰值,约为8.96%,能明显增强ADE效应。6.病毒抗体免疫物感染表达不同FcR的BHK-21细胞模型,16h流式细胞术检测病毒量,发现BHK-CD32a与BHK-CD32b细胞内病毒含量相当,分别为24.5%和23.1%。BHK-CD32a+b细胞内病毒量略低于前二者,约为18.1%,具有统计学差异。四、结论1.本研究成功获得全长prM的多克隆抗体及1株能稳定分泌抗prM蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,经间接ELISA和Western Blot鉴定抗体效价高,特异性好。在感染THP-1细胞体外模型中,与DENV-2结合后具有明显的ADE效应。2.本研究成功地制备出单独表达FcγRⅡa的pcDNA3.1 (-)-CD32a,单独表达Fc γ RⅡb的pcDNA3.1 (-)-CD32b以及共表达FcγRⅡa和FcγRⅡb的IRES-CD32a+b真核表达载体,建立起表达不同FcR的BHK-21细胞模型。发现单独表达FcγRⅡa与FcγRⅡb的BHK-21细胞感染率相当,共表达FcγRⅡa和FcγRⅡb的BHK-21细胞,在感染后初期,较单独表达FcγRⅡa与FcγRⅡb的BHK-21细胞感染率稍低,FcγRⅡb可能通过与FcγRⅡa交联抑制ADE作用。