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猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪的一种高度接触性呼吸道疾病,该病分布广泛,给各地养猪业造成了严重的经济损失。目前用于防制该病的主要还是灭活疫苗,由于APP灭活疫苗在实际应用中存在着诸多的局限,因此稳定、高效、交叉免疫性好的基因工程弱毒疫苗便成为今后APP疫苗研发的重要方向。本研究结合APP在国内的流行现状以及本实验室已有的研究基础,重点就APP的Apx I-ELISA抗体检测方法、ApxlC基因缺失疫苗的试制以及该疫苗的交叉免疫性、安全性及免疫效力进行了研究。主要研究内容如下：1. Apx I-ELISA抗体检测方法研究通过盐析、透析、浓缩等步骤提取了APP-10型的溶血外毒素Apx I,用凝胶过滤层析法对粗提的毒素进行纯化,经SDS-PAGE电泳证实所提纯的蛋白分子量大小与预期一致(105kDa)。用提纯的Apx I作为ELISA的包被抗原,经过一系列反应条件的优化建立了用于检测APP强毒感染的Apx I-ELISA方法。确定Apx I抗原最佳包被浓度为9.17μg/mL,5%脱脂乳的最佳封闭时间为90min,待检血清的最佳稀释度为1：320,待检血清最佳作用时间为60min,兔抗猪IgG-HRP最佳工作浓度为1：6000倍稀释,兔抗猪IgG-HRP最佳作用时间为60min, TMB底物最佳作用时间为15min,阴阳性临界值确定为0.34。该Apx I-ELISA方法特异性强,敏感性高,重复性良好,与IHA试剂盒的符合率达95%。2. Apx I C基因缺失疫苗的试制(1)冻干保护剂的筛选用平板活菌计数法和分光光度法测定Apx I C基因缺失株(SWI△I C)的生长曲线,根据生长曲线可知当菌液OD600值达到3.0上下时每毫升菌液所含活菌量为最大,约为8.50×109CFU/mL。选用10%脱脂乳作为冻干保护剂的基础配方,分别与蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘油、山梨醇、谷氨酸钠、明胶等配成保护剂进行单因素试验,评价不同保护剂组分对基因缺失株SW1△I C冻干保护效果。根据单因素试验结果进一步设计正交试验,测得各组分对SW1△I C保护效果的影响大小次序为：脱脂乳>蔗糖>甘油>谷氨酸钠,确定保护剂的配方为：12%脱脂乳、5%蔗糖、3%甘油和3%谷氨酸钠,此时SW1△I C的冻干存活率达可达到17%左右,这与此前常用的5%蔗糖脱脂乳的保护效果相比,本研究筛选的保护剂对SWI△I C的存活率有较大的提高。(2)疫苗的试制及质量检验按上述优化的保护剂配方制备三批Apx Ⅰ C基因缺失疫苗,并分别对其物理性状、纯净性、含水率和存活率等质量指标进行检验,检验结果表明所制疫苗符合兽医生物制品规程中的相关要求。3. Apx I C基因缺失疫苗的交叉保护性、安全性及免疫效力试验(1)交叉保护性试验将制备的Apx I C基因缺失疫苗以2×lO7CFU (0.1LD50)的剂量每隔两周分三次免疫小鼠,三免后用10LD50的APP血清1、5、7型标准强毒分别对小鼠进行攻毒。结果显示小鼠不仅能完全抵抗同型强毒株的感染,而且对血清1、7型强毒株的攻击也有一定的交叉保护作用(保护率分别为75%、87.5%)。(2)仔猪安全性试验当对仔猪单剂量重复接种5×108CFU以及超剂量一次性接种5×109CFU的该疫苗后,仔猪只出现一过性的体温升高,没有出现呼吸道症状,两周后剖检发现肺部也无胸膜肺炎等病理变化,表明在该剂量范围内免疫对仔猪是安全的。(3)仔猪免疫效力试验采用气管内注射和颈部肌肉注射两种途径对仔猪进行免疫效力试验,每隔两周免疫一次,共免疫三次,免疫剂量均为5×108CFU,每次免疫前对猪前腔静脉采血分离血清,并用IHA试剂盒以及本研究建立的Apx I-ELISA方法测定血清抗体水平,三免后用1×109CFU剂量的APP-5型标准强毒对其攻毒。结果发现这两种免疫途径均能诱导仔猪产生较高滴度的抗体,且能完全抵抗APP-5型标准强毒的感染,但气注途径诱导的Apx I抗体滴度要略高于肌注途径。