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视网膜色素变性(retinitis pigmentosa, RP)是一组以进行性感光细胞功能丧失为特征的遗传性视网膜变性疾病,是遗传性视觉损害和盲目的最常见原因。皇家外科学院(Royal College of Surgeon rat, RCS)大鼠是研究视网膜色素变性的经典动物模型,其视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cell, RPE)不能发挥其吞噬功能,吞噬功能障碍将导致周期性脱落的视杆外节膜盘(orduoetresmgnet, ROS)不能及时被吞噬,大量堆积于视网膜下腔,从而引起视觉功能障碍,导致自身生理功能丧失,加重RP的发展。视网膜小胶质细胞在视网膜发育和变性过程中起“清道夫”的作用,清除凋亡细胞。因此,加强小胶质细胞识别、吞噬凋亡的视杆细胞,可以减轻凋亡细胞对临近组织的毒性作用,维持视网膜微环境的稳定,从而有效清除堆积在视网膜下腔的ROS,起到保护健康的视锥细胞,保护残存中心视力的作用。乳脂球上皮生长因子-8(milk fat globule epidermal growth factor 8, MFG-E8)最早发现由淋巴器官的吞噬细胞分泌,是介导吞噬细胞发挥吞噬功能的关键因子,通过CrkⅡ-DOCK180-Rac1信号通路发挥作用。在RCS大鼠视网膜色素变性过程中,视网膜小胶质细胞发挥吞噬功能,是否也有MFG-E8参与,是否也通过该通路发挥作用,这一涉及神经免疫调节的基础性问题还未有研究者涉足。如果小胶质细胞吞噬功能的调节确实有MFG-E8的参与,那么外源性加入MFG-E8有可能加强其吞噬功能,进而保护残存的感光细胞,对治疗RP也具有积极意义。本研究的目的：研究视网膜小胶质细胞在RCS大鼠视网膜色素变性过程中的活化规律：MFG-E8在RCS大鼠视网膜色素变性过程中的表达规律；MFG-E8与视网膜小胶质细胞的关系；CDllb、MFG-E8及相关细胞因子的mRNA在视网膜发育和变性过程中的表达变化规律。方法1)鼠龄为14、35、60、90 d的RCS大鼠,采用免疫荧光染色技术标记视网膜小胶质细胞(标志物CDllb)。2)鼠龄为14、35、60、90 d的RCS大鼠,采用免疫荧光染色技术标记MFG-E8。3)鼠龄为14、35、60、90 d的RCS大鼠,采用免疫荧光染色双标技术标记MFG-E8和视网膜小胶质细胞(标志物CDllb)。4)选取鼠龄为0、3、7、14、30、45、60、90d的RCS大鼠,荧光实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测CDllb、MFG-E8、TNF-α、IL-1β、MCP-1、αv及β5的mRNA的表达变化。结果1)免疫荧光染色显示,鼠龄为14d的RCS大鼠CDllb阳性细胞分布于视网膜的内层,主要为视网膜神经节细胞层(ganglion cells layer, GCL)和内丛状层(Inner plexiform layer, IPL),在内核层(Inner nuclear layer, INL)可见少量的CDllb阳性细胞。鼠龄为35d的RCS大鼠CDllb阳性细胞主要分布在视网膜内丛状层,少量细胞迁移至外核层(Outer plexiform layer,OPL)。鼠龄为60 d的RCS大鼠CDllb阳性细胞迁移至外核层,在外核层明显活化。鼠龄为90 d的RCS大鼠CDllb阳性细胞分布于外核层之外,阳性细胞数量较60d少。2)免疫荧光染色显示,鼠龄为14d的RCS大鼠MFG-E8阳性细胞主要分布于视网膜神经节细胞层(ganglion cells layer, GCL)。鼠龄为35d的RCS大鼠MFG-E8阳性细胞主要分布在视网膜内核层(Inner plexiform layer, IPL),少量细胞迁移至外核层(Outer plexiform layer,OPL)。鼠龄为60 d的RCS大鼠MFG-E8阳性细胞迁移至外核层,在外核层明显活化。鼠龄为90 d的RCS大鼠MFG-E8阳性细胞分布于外核层之外,与60d相比,阳性细胞数量较少。3)免疫荧光染色显示,MFG-E8免疫阳性细胞在RCS大鼠14、35、60、90d均与CDllb染色部位相同,且阳性细胞逐渐从内核层迁移至外核层。4)Real-time PCR检测结果显示,正常大鼠和RCS大鼠神经层视网膜胚后发育过程中(P0-14),MFG-E8 mRNA的表达水平在出生早期较低,然后逐渐增加.P7-P14的mRNA表达最为强烈,与P0比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。正常大鼠在神经层视网膜发育成熟后,MFG-E8 mRNA的表达水平与P0比较,差异不具有统计学意义(P>0.05)。而RCS大鼠在神经层视网膜变性过程中(P14-P90),其mRNA表达逐渐增加；P30、P45与PO比较,差异具有统计学意义(P<0.05)；P60 mRNA的表达达到高峰,与P0比较,差异具有统计学意义(P<0.05)；P90与P0比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。整合素αv和β5与MFG-E8的mRNA表达变化一致。5)Real-time PCR检测结果显示,正常大鼠和RCS大鼠神经层视网膜胚后发育过程中(P0-P14),CD11bmRNA的表达水平在出生早期较低,然后逐渐增加。P7-P14的mRNA表达最为强烈,与PO比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。正常大鼠在神经层视网膜发育成熟(P14)后,MFG-E8 mRNA的表达水平与P0比较,差异不具有统计学意义(P>0.05)。而RCS大鼠在神经层视网膜变性过程中(P14-P90),其mRNA表达逐渐增加.P30、P45与P0比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。P60 mRNA的表达达到高峰,与P0比较,差异具有统计学意义(P<0.05)；P90与P0比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。细胞炎性因子TNF-α(肿瘤坏死因子)、IL-1β(白介素1-β)及细胞趋化因子MCP-1,其nRNA表达变化均与CD11bmRNA表达变化一致。结论1)RCS大鼠视网膜色素变性过程中：CD11b标记的视网膜小胶质细胞明显活化,并向外核层迁移；阳性细胞数量先增多后减少,P60达到高峰；视网膜小胶质细胞的活化可能在视网膜变性过程中发挥重要作用。2)RCS大鼠视网膜色素变性过程中：MFG-E8标记的阳性细胞数量先增多后减少,P60达到高峰；肯定了MFG-E8在视网膜中的表达。3)RCS大鼠视网膜色素变性的各个阶段,CD11b标记的视网膜小胶质细胞与MFG-E8标记的阳性细胞相同,确定MFG-E8表达于神经层视网膜小胶质细胞；MFG-E8可能在视网膜小胶质细胞吞噬过程中发挥重要作用。4)在RCS大鼠视网膜色素发育和变性过程中,整合素αv、β5和MFG-E8与CD11b(小胶质细胞的特异标记物)的mRNA表达变化规律表现出一致性,提示：MFG-E8介导神经层视网膜小胶质细胞的吞噬作用,且可能通过CrkⅡ-DOCK180-Rac1信号通路吞噬凋亡细胞。5)炎性相关因子TNF-α、IL-1β、MCP-1的mRNA表达变化与CDllb(小胶质细胞的特异标记物)表达变化规律一致,提示在RCS大鼠视网膜色素变性过程中,小胶质细胞介导炎症反应。