红曲霉—人参双向固体发酵及其产物药理活性研究

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目的:以人参为药性发酵基质,药用真菌红曲霉为发酵菌株进行双向固体发酵。以Monacolin K的含量为参照指标,进而优化发酵条件,利用现代分析技术证明发酵终产物兼具药用真菌红曲霉和人参的主要药效成分和功能。并过通体外和体内的药理实验考察发酵产物的降血脂和体外抗肿瘤的药理活性。  方法:以pH、装料量、初始含水量、培养时间、接种量、种龄、培养温度、碳源、氮源9个单一的因素对发酵产物中的Monacolin K的含量的影响,设计出单因素试验。并在此基础上,选出以pH、初始含水量、培养时间、接种量四种因素及相应三种水平进行正交试验,以Monacolin K的含量为工艺参数,得出最优的发酵条件。利用TLC和HPLC手段对发酵产物的主要活性成分进行了定性分析。最后对发酵产物进行了降血脂和体外抗肿瘤的药理活性研究。通过高脂饲料的喂养,建立起了实验性高脂血症小鼠模型,然后对模型小鼠进行低(400 mg/kg)、中(800 mg/kg)、高(1600 mg/kg)剂量的梯度给药,最终测定发酵产物对小鼠血清当中的总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量的影响。同时将发酵产物用DMSO(二甲基亚矾)配制成200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml四个浓度,利用MTT法考察发酵产物体外对Hela(宫颈癌细胞)的抑制率。  结果:红曲霉—人参双向固体发酵的最佳发酵工艺条件为:100 ml发酵药瓶中装10 g人参粉末,再添加4.5%可溶性淀粉,1.2%酵母膏,0.2%NaNO3,0.2%KH2PO4,0.2%MgSO4,调整初始含水量为60%,接种10%的种龄为48 h的种子液,用乳酸调pH=2.0,恒温培养箱26℃下培养15 d。通过TLC法可以得出,红曲酶—人参发酵产物中含有酸式Monacolin K,再通过TLC和HPLC法共同得出,红曲酶—人参发酵产物中人参皂苷成分略有变化,说明红曲菌具有一定的转化人参皂苷的能力,并转化出人参稀有皂苷Rg3。在降血脂实验中,给药组与实验性高脂血症小鼠模型组比较,阳性对照组、高剂量给药组及中剂量给药组均能显著性的(p<0.05)或极显著性(p<0.01)的降低高脂血症小鼠TG、TC和LDL-C的含量,中剂量和高剂量组降低TG、TC和LDL-C含量的趋势要好于阳性对照组,但无显著性差异(p>0.05);中剂量组、高剂量组和阳性对照组的HDL-C的含量极显著的高于高脂模型组(p<0.01),且高剂量组HDL-C的含量增高趋势显著性高于阳性对照组(p<0.05)。在体外抗肿瘤实验中,红曲霉-人参发酵产物对Hela细胞的生长有抑制作用,且随着给药浓度的升高,对Hela细胞增殖的抑制率也逐渐升高,发酵产物给药浓度为200μg/ml,100μg/ml,50μg/ml,25μg/ml时对Hela细胞的抑制率分别为50.89%、36.19%、23.18%、20.66%。与浓度为25μg/ml组的抑制率相比较,200μg/ml,100μg/ml给药组极显著的抑制Hela细胞的增殖(p<0.01)。50μg/ml给药组比25μg/ml给药组在抑制Hela细胞增殖的方面有较好的趋势,但是差异显著性并不明显(p>0.05)。  结论:1.红曲霉在以人参为发酵基质的培养基上生长良好,发酵产物兼具红曲霉和人参的主要药效成分和功效。2.发酵产物中检测出具有降血脂功效的有效成分Monacolin K。3.红曲霉具有转化人参皂苷的一定能力,并转化出人参稀有皂苷Rg3。4.红曲霉-人参的发酵产物具有很好的降血脂功效。5.红曲霉-人参发酵产物对Hela细胞的增殖有明显的抑制作用。
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