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研究背景和目的随着恶性肿瘤的发病率日益上升,其治疗和预防也成为了人类医学研究的热点和难点。由于肿瘤本身容易发生侵袭转移和复发的生物学特性和临床特征,使得传统的治疗手段效果有限,副作用多;因此肿瘤疫苗近年来做为治疗的新型手段收到越来越多的关注,其原理是通过激活患者自身免疫系统,利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应,阻止肿瘤的生长、扩散和复发,以达到清除或控制肿瘤的目的。肿瘤疫苗是近年来国内外研究的热点之一,来源于自体或异体肿瘤细胞或其粗提取物,带有肿瘤特异性抗原（tumor specific antigen,TSA）或肿瘤相关抗原（tumor associated antigen,TAA）。其原理是通过体外分离、提取、制备不同形式的疫苗注射到肿瘤或患者体内,激活患者自身免疫系统,利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应,克服肿瘤产物所引起的免疫抑制状态,增强TAA的免疫原性来清除肿瘤。TSA的免疫治疗可以启动以肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic Tlymphocyte,CTL）反应为主的特异性抗肿瘤效应,有效杀伤肿瘤细胞,同时预防了肿瘤的转移和复发。它既可以独立地治疗肿瘤,又可与手术及放、化疔结合,具有疗效高、特异性强、不良反应小等优点。目前,在肿瘤治疗中应用的疫苗主要包括以下几种类型:肿瘤细胞疫苗,肿瘤抗原疫苗（肿瘤多肽疫苗）,单克隆抗体疫苗,核酸疫苗,DC疫苗等。其中蛋白质疫苗是肿瘤抗原疫苗的一种,它使用天然蛋白质或重组蛋白质作为疫苗,可联合应用佐剂或细胞因子。蛋白质作为一种大分子物质,其表面存在大量的抗原表位,经抗原递呈细胞加工提呈后诱导机体产生特异性细胞及体液免疫应答。因此,如何确定针对性强的肿瘤相关抗原编码基因,如何有效保证目的基因在体内充分表达,以及如何有效促进和提高机体免疫系统对肿瘤抗原的识别、呈递、处理和扩增等问题,是目前肿瘤疫苗研究重点[1-4]。表皮生长因子受体通路底物8（Epidermal growth factor receptor substrate 8,EPS8）是一种97 kD的蛋白,其编码基因定位于12q23-q24,具有一个68 kD的亚型（P68）。其结构主要包含N端的PTB域,中间的EGFR结合域和SH3域,以及C端一个多功能的结构域,P68缺少C端的这个多功能结构域。高度表达的EPS8可以在EGFR通路激活被限制的条件下,恶性转化NIH3T3细胞;另外还在人骨肉瘤、纤维肉瘤、喉癌、膀胱癌来源的细胞株中,发现EPS8被酪氨酸磷酸化,因此有研究认为EPS8作为EGFR激活信号传导通路的一部分,参与细胞的恶变[6-9]。多方面研究证实,EPS8在口腔鳞癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌等多种实体肿瘤中表达量异常增高,并且高表达的EPS8与肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭能力增强具有显著相关性。最新的文章报道:EPS8广泛表达于各种肿瘤组织,正常组织中只有微量表达或没有表达。以上研究结果提示:EPS8参与肿瘤的发生、发展过程,在恶性肿瘤的表达具有高度的选择性,并且与肿瘤预后不佳、肿瘤复发有一定的关系,是具有潜在应用价值的肿瘤标志物[11-13]。本实验拟构建重组小鼠EPS8疫苗,通过体外实验和荷瘤小鼠体内实验,观察疫苗对T细胞增殖杀伤能力的影响、细胞因子分泌、T细胞亚群变化、细胞毒效应分析、肿瘤生长曲线等多项指标,探讨EPS8蛋白疫苗的抗肿瘤效应,为寻求恶性肿瘤的新型治疗手段提供理论基础和实验依据。目的1.构建并表达小鼠重组EPS8蛋白;2.采用MTT法和LDH法检测EPS8蛋白致敏DC后对T淋巴细胞的增殖及对4T1的杀伤效应的影响;3.将EPS8蛋白疫苗应用于荷4T1乳腺癌小鼠肿瘤模型,观察疫苗是否抗肿瘤作用效果,初步探讨其作用机理。方法第一部分EPS8蛋白的构建、表达及纯化常规方法培养4T1,TRIzol法提取总RNA,反转录cDNA第一链做为PCR模板,自行设计引物扩增Eps8目的片段,连接于表达载体pET28a,转化大肠杆菌BL21。采用IPTG诱导EPS8蛋白表达,用超声破碎法裂解表达EPS8蛋白的大肠杆菌BL21以提取EPS8蛋白,采取Ni-NTA柱亲和层析纯化,超滤柱浓缩蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳及Western Blot方法鉴定EPS8表达的正确性,BCA法测定EPS8蛋白浓度。第二部分EPS8蛋白致敏DC后对T淋巴细胞的增殖及杀伤效应的影响1.小鼠DC体外诱导培养及鉴定取BALB/c小鼠,无菌取骨髓细胞,加入GM-CSF、IL-4及TNF-α诱导培养,分为成熟DC组、EPS8致敏DC组、OVA致敏DC组（OVA为对照）,流式细胞术检测DC细胞表型CD86、MHCⅡ、CD80及CD11c,ELISA检测小鼠DC分泌IL-12的水平。2.小鼠T淋巴细胞体外诱导培养及鉴定取BALB/c小鼠,无菌取脾细胞,加入IL-2诱导培养,于第8天在倒置显微镜下观察细胞形态和数量的变化,ELISA检测INF-y分泌。3.MTT法检测T淋巴细胞增殖,LDH细胞毒试剂盒检测CTL对4T1的杀伤效应4.统计分析所得数据取平均值以均数±标准差（x±s）表示。采用SPSS 13.0 for windows统计软件进行统计分析:①两组均数比较采用两独立样本t检验（two independent-samples t test）;②三组均数比较采用采用单向方差分析方法（one-way ANOVA）进行统计分析,多重比较采用LSD法。③不同组间不同检测时间IL-12及IFN-γ分泌水平的比较,采用析因设计资料的方差分析。P＜0.01为差异非常显著,P＜0.05为差异显著。第三部分EPS8疫苗对4T1荷瘤小鼠抗肿瘤效应的实验研究1.BABL/c小鼠血清中抗EPS8抗体滴度的测定将BABL/c小鼠分成EPS8疫苗组和佐剂对照组进行免疫,每周一次,共3次。两组小鼠均分别于免疫前、免疫1次后、免疫2次后、免疫3次后取血,间接Elisa检测法测定血清中抗EPS8抗体滴度。2.流式细胞术检测小鼠免疫前后T淋巴细胞亚群比例的变化3.小鼠体内抗肿瘤实验（1）将16只雌性BALB/c小鼠随机分为EPS8疫苗组和佐剂对照组,分别进行免疫,于小鼠第三次免疫7天后,皮下接种4T1细胞。动态观察肿瘤形成情况,记录小鼠生存期及测量肿瘤体积,比较两组小鼠肿瘤重量,计算抑瘤率。（2）T细胞免疫功能指标的检测建立免疫鼠肿瘤模型,接种肿瘤后第28天,流式细胞术检测脾T淋巴细胞亚群比例,LDH法检测细胞毒性。4.统计学方法:所有数据采用均数±标准差（x±s）表示,用SPSS 13.0 for windows统计软件进行统计分析。采用的统计学方法有:①小鼠生存率采用Kaplan-Meier法分析,两组生存时间比较采用Log-Rank法。②两组小鼠肿瘤体积比较,采用重复测量数据的方差分析方法进行多水平比较。③EPS8疫苗组和佐剂对照组组内CD4+、CD8+T细胞的百分比、CD4+/CD8+比值不同检测时间之间的比较,EPS8疫苗组和佐剂对照组组间不同效靶比CTL杀伤活性的比较,方差齐,采用one-way ANOVA进行统计分析,用LSD方法进行组间两两比较;方差不齐,用Welch方法进行多组间比较,用Dunnett’s T3方法进行组间两两比较。④不同组间不同检测时间CD4+、CD8+T细胞的百分比、CD4+/CD8+比值的比较,不同组间不同效靶比对靶细胞的杀伤活性比较,采用析因设计资料的方差分析。⑤两组肿瘤重量、CD4+CD25+Treg/CD4+T细胞比值的比较,同一检测时间不同组间CD4+、CD8+T细胞的百分比、CD4+/CD8+比值的比较,同一效靶比不同组间CTL杀伤活性的比较,先采用Levene方差齐性检验,若方差齐,采用两独立样本t检验;方差不齐,采用两独立样本t’检验。以上统计方法均采用显著性水准α=0.05。结果第一部分EPS8蛋白的构建、表达及纯化BCA法测定的蛋白浓度为0.96-3.346mg/L菌,SDS-PAGE电泳及Western Blot结果显示从大肠杆菌中提取的蛋白为特异性目的蛋白EPS8。第二部分EPS8蛋白致敏DC后对T淋巴细胞的增殖及杀伤效应的影响1.小鼠DC体外诱导培养及鉴定培养第8天观察细胞数量多分散,贴壁生长,细胞表面有大量细小毛刺样突起形成。流式细胞术检测DC细胞表型CD86、MHCⅡ、CD80及CD11c,成熟 DC 组的细胞表型为:CD80 88.14±0.98,CD86 87.1±2.68,CD11c 87.17±4.22,MHC-Ⅱ 56.04±5.85;EPS8 致敏 DC 组的细胞表型为:CD80 92.79±1.84,CD8693.32±1.18,CD11c 90.05±3.33,MHC-Ⅱ 76.5±4.65,EPS8 致敏组 DC 的 CD80、CD86、MHC-Ⅱ较成熟DC组的表达有所提高（P＜0.05）,EPS8致敏组DC的CD11c较成熟DC组的表达未见明显增高（P＞0.05）。ELISA检测IL-12分泌水平:EPS8致敏DC组在第1天,第3天及第5天IL-12的分泌水平分别为50.08±4.69pg/ml,62.58±0.76 pg/ml,48.47±3.83 pg/ml;OVA 致敏 DC 组在第 1天,第3天及第5天IL-12的分泌水平分别为25.86±1.98 pg/ml,36.41±1.02 pg/ml,21.85±2.24pg/ml,两组数值比较差异非常显著（P＜0.01）,且随着时间的延长出现高峰值。2.小鼠T淋巴细胞体外诱导培养及鉴定T淋巴细胞呈悬浮状,细胞体积较小呈圆形,数量较前明显增多。ELISA试剂盒检测INF-γ分泌水平:EPS8致敏DC组在第1天,第3天及第5天INF-γ的分泌水平分别为 46.34±1.84pg/ml,46.81±0.94pg/ml,45.87±0.24pg/ml;OVA致敏DC组在第1天,第3天及第5天INF-γ的分泌水平分别为36.65±1.15 pg/ml,37.61±1.81 pg/ml,35.19±0.24pg/ml;两组数值比较差异非常显著（P＜0.01）3.MTT法检测T淋巴细胞增殖,LDH细胞毒试剂盒检测CTL对4T1的杀伤效应各组的T淋巴细胞增殖大小分别为:未致敏DC组1.69±0.41,EPS8致敏DC组3.28±0.34,OVA致敏DC组2.08±0.27。经统计分析表明,EPS8致敏DC组与未致敏DC组、OVA致敏DC组比较差异均非常显著（P＜0.001）。各组对4T1的杀伤效率分别为:未致敏DC组37.50%±8.52%,EPS8致敏DC组54.89%±4.99%,OVA致敏DC组22.74%±5.37%,经统计分析表明,EPS8致敏DC组与未致敏DC组、OVA致敏DC组比较差异均非常显著（P＜0.01）。第三部分EPS8疫苗对4T1荷瘤小鼠抗肿瘤效应的实验研究1.EPS8抗体滴度的测定佐剂对照组血清中抗EPS8抗体为阴性,EPS8疫苗组抗EPS8抗体为阳性,第1,2,3次免疫后小鼠血清抗EPS8抗体的平均滴度分别为1:40,1:87.24,1:174.48,以上结果显示,随着免疫次数的增加,小鼠体内抗EPS8抗体滴度呈上升趋势。2.流式细胞术检测小鼠免疫前后T淋巴细胞亚群比例在荷瘤小鼠模型中,EPS8疫苗组小鼠脾CD4+T细胞百分比和CD4+/CD8+的比值分别与佐剂对照组小鼠的脾CD4+T细胞百分比和CD4+/CD8+的比值比较,差异有统计学意义（P＜0.001;P=0.001）,EPS8疫苗组小鼠脾CD4+T细胞百分比高于佐剂对照组小鼠的脾CD4+T细胞百分比,EPS8疫苗组小鼠脾CD4+/CD8+比值也高于佐剂对照组CD4+/CD8+的比值。免疫后两组小鼠脾CD4+、CD8+T细胞的百分比、CD4+/CD8+的比值与免疫前比较差异均无统计学意义（P＞0.05）,免疫后两组之间脾CD4+、CD8+T细胞的百分比、CD4+/CD8+的比值比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。流式细胞术检测小鼠脾CD4+CD25+Treg,结果显示佐剂对照组与EPS8疫苗组CD4+CD25+Treg/CD4+T细胞的比值差异有统计学意义（P＜0.001）,EPS8疫苗组CD4+CD25+Treg/CD4+T细胞的比值要低于佐剂对照组CD4+CD25+Treg/CD4+T细胞的比值。3.小鼠生存期的观察、肿瘤重量的比较、肿瘤体积的测量,抑瘤率的计算佐剂对照组小鼠在接种细胞后50天内全部死亡,其中位生存时间是37（34,40）天;EPS8疫苗组中位生存时间是44（38,50）天。EPS8疫苗组小鼠生存期高于佐剂对照组小鼠生存期,两组生存期差异有统计学意义（P＜0.05）。动态观察小鼠肿瘤体积,两组体积变化比较差异无统计学意义（P＞0.05）。EPS8疫苗组小鼠肿瘤重量（2.21±0.35g）低于佐剂对照组小鼠肿瘤重量（3.31±0.88g）,差异有统计学意义（P＜0.01）EPS8疫苗的抑瘤率为33.23%。4.用LDH细胞毒杀伤检测试剂盒检测CTL活性不同效靶比之间细胞杀伤率比较差异有统计学意义（F=9.018,P=0.001）。在各效靶比作用下,两组细胞杀伤率组间比较差异有统计学意义（F=35.301,P＜0.001）。EPS8疫苗组各效靶比之间比较,CTL杀伤率差异有统计学意义（F=10.674,P=0.001）。佐剂对照组各效靶比之间比较,CTL杀伤率差异无统计学意义（F=1.731,P=0.201）。效靶比为20:1和40:1时,EPS8疫苗组与佐剂对照组CTL对靶细胞的杀伤活性比较差异有统计学意义（t=2.263,P=0.040;t=5.810,P＜0.001）,EPS8疫苗组CTL对靶细胞的杀伤活性高于佐剂对照组CTL对靶细胞的杀伤活性。结论1.成功构建了原核重组表达载体pET28a-Eps8,表达并纯化了 EPS8蛋白。2.通过MTT法和LDH细胞毒检测法证实了 EPS8致敏DC可促进T淋巴细胞增殖,并且可特异性增强CTL对小鼠乳腺癌细胞4T1的杀伤效应。3.EPS8疫苗能够维持荷瘤小鼠脾CD4+T细胞/CD8+T细胞比值,能降低荷瘤小鼠脾脏CD4+CD25+T细胞/CD4+T细胞的比例,调节CD4+CD25+T细胞造成的免疫抑制作用。4.EPS8疫苗可以延长4T1荷瘤小鼠生存期,抑制肿瘤的生长。