论文部分内容阅读
帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是一种以黑质纹状体多巴胺能神经元进行性退化为特征的神经退行性疾病。PD治疗的关键是递送有效量的药物入脑发挥作用,补充脑内缺失的多巴胺仍是目前最有效的治疗方法。当前递送药物入脑存在两方面问题:一是药物递送量少,血脑屏障（Blood Brain Barrier,BBB）的存在阻止大多数药物入脑发挥作用,其仅允许小的亲脂性药物跨越;二是药物入脑后分布范围广,脑内药物分布无选择性。本课题旨在设计一种多巴胺经鼻脑靶向递药系统,利用冰片的促渗作用促进药物经鼻腔递送入脑,以乳铁蛋白为靶向分子修饰纳米粒（Nanoparticles,NPs）使其入脑后浓集于PD病变部位实现靶向性,从而实现PD的有效治疗,降低毒副作用:将冰片和多巴胺共包载于聚乙二醇-羟基乙酸共聚物（Methoxy Poly（ethylene glycol）-b-poly（lactide-co-glycolide）,MPEG-PLGA）为载体的纳米粒中,用乳铁蛋白（Lactoferrin,Lf）作为靶向分子修饰纳米粒实现主动靶向,并进行体外和体内评价,为该纳米递药系统在PD治疗中的开发提供依据。本课题的主要研究内容如下:1.纳米粒的制备与表征通过乳化溶剂挥发法制备共包载冰片和多巴胺纳米粒（Borneol and Dopamine Co-loaded Nanoparticles,DA BNPs）,采用单因素考察法优化处方和工艺,确定最优处方工艺如下:多巴胺理论载药量为30%,冰片理论载药量为4%,聚合物浓度为20 mg/mL,油相为二氯甲烷,外水相为1%PVA水溶液,超声功率为300 W。然后将巯基化的Lf与纳米粒表面的马来酰亚胺基连接得到Lf修饰的共包载冰片和多巴胺纳米粒（DA Lf-BNPs）。通过最优处方工艺制备的DA Lf-BNPs粒径为（160.7±16.7）nm,多巴胺载药量为（7.98±1.80）%,冰片载药量为（1.78±0.22）%,Zeta电位为（-21.70±3.39）mV。体外释放结果表明将多巴胺包载在纳米粒中在PBS（pH 7.4）的释放介质中具有良好的缓释特性。2.纳米粒的细胞毒性与细胞摄取评价研究通过考察纳米粒对人骨髓神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）和支气管上皮细胞（16HBE）的毒性和摄取行为,评价所构建递药系统对脑组织和鼻粘膜的毒性和递药特性。采用MTT法考察空白纳米粒和包载多巴胺纳米粒的细胞毒性,研究结果说明空白纳米粒具有较好的安全性和生物相容性,将多巴胺包载于纳米粒后细胞毒性显著低于游离多巴胺组。将荧光探针尼罗红或香豆素-6包载于纳米粒中,通过倒置荧光显微镜定性观察尼罗红纳米粒的摄取行为,流式细胞仪定量考察香豆素-6纳米粒的摄取,研究结果说明对于SH-SY5Y细胞,Lf修饰纳米粒能显著增强摄取,具有更好的脑靶向性;对于16HBE细胞,共包载冰片和Lf修饰能够协同促进细胞摄取。3.纳米粒的脑靶向性评价采用活体动物成像技术,将荧光探针DiR碘化物包载于纳米粒中经鼻给药后定性评价纳米粒的脑靶向性。实验结果显示Lf-BNPs组的荧光强度更强,说明共包载冰片和Lf修饰能协同促进药物经鼻递送入脑,实现更好的脑靶向性。而且,经鼻给药后药物主要浓集在脑组织,在其它器官分布很少,进一步说明经鼻给药和传统给药方式（口服给药和静脉给药等）相比能够显著降低药物毒性。4.纳米粒的药代动力学研究本研究考察纳米粒大鼠经鼻给药后在血及脑内的药代动力学行为。实验结果显示,纳米粒经鼻递送后,血中的药代动力学行为相似,这说明Lf修饰和共包载冰片对于纳米粒经鼻递送后进入血液的行为没有显著影响。而脑组织中Lf-BNPs组的AUC0-12h值为（1696.4±119.3）ng·h/g,与Lf-NPs组（（1341.8±109.8）ng·h/g）和NPs组（（830.6±108.9）ng·h/g）相比具有显著性差异（p<0.05）,研究证明结果Lf修饰和共包载冰片能够显著增加纳米粒递送入脑的量,并实现靶向性。5.纳米粒的药效学评价为了评价构建的递药系统对PD的治疗作用,通过大鼠单侧纹状体注射6-OHDA诱导其多巴胺能神经元损伤制备PD模型,以PD大鼠对侧旋转行为及脑内多巴胺和其代谢物含量评价纳米粒的药效。实验结果说明Lf-BNPs组PD大鼠经鼻给药20天后,其对侧旋转圈数较Lf-NPs组相比显著降低（p<0.05）,损伤侧纹状体多巴胺和二羟基苯乙酸水平较PBS组相比有非常显著的增加（p<0.01）。这证明构建的递药系统经鼻给药后实现了更好的PD治疗效果。