【摘 要】
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产志贺样菌毒素Ⅱ型突变体大肠杆菌是水肿病的主要致病菌,志贺样菌毒素Ⅱ型突变体是仔猪水肿病的主要致病因子.志贺样毒素由具有酶活性的1个A亚基和5个结合受体的B亚基组成,
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产志贺样菌毒素Ⅱ型突变体大肠杆菌是水肿病的主要致病菌,志贺样菌毒素Ⅱ型突变体是仔猪水肿病的主要致病因子.志贺样毒素由具有酶活性的1个A亚基和5个结合受体的B亚基组成,采用定点突变的方法可稳定地减弱SLT-Ⅱv的酶活性,成熟A亚基的167位Glu被Gln替代、170位Arg被Lys替代可分别使其细胞毒性下降10<6>倍和10倍,酶活性分别下降大约1500倍和5倍.176位的Arg被Gly替代,其毒力也会明显减弱.本文以SLTⅡv上一段保守的DNA序列为依据,合成一对特异的寡核苷酸引物,建立了聚合酶链式反应(PCR)检测产SLT-Ⅱv菌株;从贵州省各个地区采集的腹泻粪样中分离到400多株大肠杆菌,其中的19株含有SLTⅡv基因;以其中一株大肠杆菌P22为实验材料,通过一对特异性引物,SLTⅡvAmf2)和(SLTⅡvAmr 3)对SLT-Ⅱv的A亚基DNA序列进行人工定点突变,应用另一对引物,SLTⅡv Aupl和SLTⅡv Adown4经PCR扩增出定点突点了的A亚基DNA序列,引物SLTⅡ vAupl包含Kpn Ⅰ的酶切位点,引物SLT Ⅱ v Adown4包含EcoR Ⅰ的酶切位点,采用pRSET表达载体克隆定点突变了的SLT-Ⅱv的A亚基,得到重组质粒pRSET-SLTⅡvA,其中包括终止码TGA.将重组质粒pRSET-SLTⅡvA导入大肠杆菌BL21中,为下一步融合蛋白的表达奠定了基础.
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