自然杀伤细胞(Natural killer cell, NK细胞)作为固有免疫系统的重要成员在机体抗肿瘤免疫中扮演重要的角色。使用NK细胞进行抗肿瘤治疗已引起人们高度的重视,目前已有研究进入了临床实验阶段。基于NK细胞的肿瘤免疫治疗包括内源性NK细胞的诱导活化、同种反应性NK细胞输注、体外扩增的自体或供者NK细胞及NK细胞系的过继转输等。相比较而言,自体或同种异体NK细胞在进行抗瘤治疗时存在一定的局限性,而永生化的人NK细胞系因具有较强的细胞毒作用、体外易扩增培养、且不存在其他细胞污染等优点,可以克服自体或异体NK细胞的局限性,具有很好的临床应用前景。现有可用于肿瘤治疗的NK细胞系(NK-92细胞)由西方国家建立,尽管HLA分子不匹配是NK细胞行驶功能的有益因素,但是由于不同种族间HLA分子的差异很可能在受者体内产生抗HLA的抗体从而抑制免疫治疗的效果,故西方国家建立的NK细胞系可能不适合用于中国肿瘤病人的治疗。因此,建立国人的NK细胞系并将其用于肿瘤治疗尤为重要。另外,肿瘤的诊断及分期对于临床治疗方案的制定至关重要。肺癌作为恶性肿瘤中最常见的死亡原因,严重威胁人类的健康。肺癌的高转移率和复发率严重阻碍肺癌患者生存期的提高,寻找用于循环肿瘤细胞监测的标志物并建立合适的检测方法成为亟需解决的问题。本研究利用流式细胞术对本室已建立的人NK细胞系(NKG细胞)的表型、活化状态及功能分子的表达进行分析；利用3H掺入实验测定不同剂量辐照后NKG细胞的增殖情况；利用51Cr杀伤实验测定NKG细胞的细胞毒活性；建立人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型评价NKG细胞的体内抗肿瘤活性；利用波浪式生物反应器建立NKG细胞大规模培养的工艺流程,建立NKG细胞主细胞库和工作细胞库,并按《药典》三部(2005年版)的相关要求进行了细胞鉴别试验、无菌试验、外源性因子检测、致瘤性检查及急性毒性试验。另外,应用实时荧光定量PCR的方法检测LunX等多种肿瘤标志物mRNA的水平,分析LunX mRNA与肺癌病理分期及临床治疗效果之间的关系。利用上述方法所取得的研究结果如下：1.NKG细胞表型及功能分子的表达NKG细胞是本研究室863课题组于2003年建立的永生化的人NK细胞株。NKG细胞悬浮生长,成团细胞较多,倍增时间为2-3天。NKG细胞的表型鉴定为CD56+CD 16-CD27- CD3-αβTCR-γδTCR- CD4- CD8- CD 19- CD 161- CD45+。NKG细胞表面表达高水平CD2、CD58、CD11a、CD54、CD11b及CD11c等粘附分子；高表达共刺激分子CD48。NKG细胞表面表达抑制性受体CD94/NKG2A、CD158b和CD85j,同时亦表达高水平NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D和NKG2C等活化性受体。另外,与细胞杀伤功能相关的TRAIL、FasL、granzyme B、perforin和IFN-γ等均在NKG细胞中表达。上述结果表明,NKG细胞具有活化性NK细胞的特征。2.NKG细胞的抗肿瘤细胞毒活性及其分子机制NKG细胞对多种肿瘤细胞系均有较强的杀伤活性,尤其是对SGC7901和Ho-8910细胞的杀伤活性>80%(E／T=20／1)。NKG细胞对Ho-8910细胞的杀伤活性明显高于NK-92、NKL及YT细胞。体外抗体阻断及中和实验表明NKG细胞的细胞毒活性主要依赖于NKG2D和NKp30识别机制。当γ辐照剂量达800cGy时,辐照后的NKG细胞失去增殖能力,但在48小时内维持其对肿瘤细胞的杀伤活性。体外实验进一步证明800cGy辐照后的NKG细胞对原代分离的人卵巢癌细胞具有较强的杀伤活性(75%-45%,E／T=20／1)。3.人卵巢癌小鼠模型中NKG细胞的免疫治疗作用利用Ho-8910细胞以腹腔注射的方式接种裸鼠,成功建立人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型。当将800cGy辐照后的NKG细胞与Ho-8910细胞按5：1混合后接种裸鼠,结果显示小鼠成瘤时间由28～44天延迟至90～135天,成瘤率由100%明显降低至50%。NKG细胞治疗组小鼠腹围明显减少,尽管在观察时间内50%小鼠死亡,但其平均生存时间由61.5天明显延长至210.2天。以上结果表明NKG细胞在小鼠体内对人卵巢癌细胞具有明显的杀伤功能。当在Ho-8910细胞接种后第21天,给予800cGy辐照后的NKG细胞进行治疗,结果表明治疗组小鼠成瘤时间由28～38天延后至56～66天,小鼠成瘤率由100%降低至62.5%,成瘤鼠病情进展较缓慢,平均生存时间由64.6天延长至119.6天。当在Ho-8910细胞接种后第35天选择已成瘤小鼠,给予800cGy辐照后的NKG细胞进行治疗,结果表明治疗后小鼠腹围变化较对照组明显减慢,尽管最终治疗组小鼠亦全部死亡,但其平均生存时间由64.2天明显延长至93.6天。上述动物模型的结果表明,辐照后NKG细胞具有明显的治疗卵巢癌的作用。4.NKG细胞大规模培养工艺的建立利用波浪式生物反应器建立NKG细胞大规模连续培养的工艺流程,具体流程如下：接种密度：2.0×104cells／ml；培养基：a-MEM完全培养基(a-MEM液体培养基含10%新生牛血清、10%马血清),添加终浓度为100U／ml的rhIL-2；接种体积：500ml,分别于接种后2、4、6天补加500ml完全培养基及rhIL-2溶液(终浓度为100U／ml)；最大培养体积：<2000ml。培养条件：37℃,5.0%C02,C02流速为0.15L／min,7rpm／7。。按照该工艺流程培养得到的NKG细胞数量、纯度及杀伤活性等均可满足临床治疗的要求。5.NKG细胞急性毒性检测使用高于临床使用剂量150倍的NKG细胞(1×108cells／鼠),经800cGy辐照后通过腹腔注射的方式输入C57BL／6小鼠体内,连续观察7天,三批小鼠均为未发生毒性反应、过敏反应、局部刺激反应；实验组及对照组小鼠体重增加平稳,小鼠体重及体重增加量两组之间均无显著性差异,说明NKG细胞无急性毒性作用。6.NKG细胞种子库的建立及检定利用本研究建立的NKG细胞大规模培养工艺,建立主细胞库及工作细胞库。对工作细胞库的检定结果表明,NKG细胞的表型与原始库一致,无细菌、真菌及支原体污染,外源性病毒因子检测为阴性,体内外均无致瘤性。7. LunX mRNA在非小细胞肺癌转移早期诊断及疗效评价中的作用利用实时荧光定量RT-PCR方法检测肺癌患者、健康人、肺炎患者及其他肿瘤患者(包括乳腺癌和食道癌)的外周血或胸水样品中LunX、CEA、CK19、VEGF-c、hRNP A2/B1等肿瘤标志物nRNA的水平,结果表明LunX mRNA仅在非小细胞肺癌患者的外周血(75.0%,33／44)及胸水(92.9%,13／14)中有表达,而在健康人、肺炎、其他上皮来源的肿瘤患者外周血及结核性胸膜炎胸水中均无表达,明显优于其他各种标志物,而且外周血中LunX mRNA的水平及其阳性率与肺癌的临床分期成正相关。进一步对非小细胞肺癌患者治疗前后外周血中上述基因mRNA的表达情况进行检测分析,结果表明治疗后患者外周血中LunX、CK19 mRNA水平较治疗前明显降低,治疗前后VEGF-C、CEA、hnRNP A2/B1 mRNA表达水平无明显差异。LunX与CK19 mRNA均可作为疗效评价的指标,但因CK19mRNA在其他肿瘤患者外周血中亦有表达,故LunX mRNA作为肺痛患者治疗效果评价的指标更为灵敏和特异。结论：NKG细胞具有活化的人NK细胞特征,对多种肿瘤细胞具有很强的细胞毒作用。利用人卵巢癌裸鼠腹水瘤模型证明NKG细胞具有明显的抗肿瘤效应,特别是对晚期肿瘤亦具有明显的治疗效果。NKG细胞的应用将可能成为一种新的肿瘤免疫治疗方法。在此基础上,建立了体外大规模扩增NKG细胞的工艺流程,并建立了合格的主细胞库和工作细胞库,为NKG细胞用于临床的肿瘤治疗奠定了基础。此外,本研究证实检测外周血及胸水中LunX mRNA表达水平将在非小细胞肺癌转移早期诊断及治疗效果评价中具有重要作用。