2型糖尿病和冠心病是中老年人的常见病和多发病。冠心病的发生除了与遗传因素有关外，还与年龄、性别、高血脂、高血压、高血糖、吸烟、高同型半胱氨酸血症、胰岛素抵抗、肥胖等多种危险因素有关。糖尿病患者由于常同时存在多种危险因素，因而其冠心病发病率较血糖正常者高2倍左右。 冠心病中各种危险因素导致了动脉内膜损伤，而动脉粥样斑块的形成是对内膜损伤作出反应的结果，因此，冠状动脉动脉粥样硬化的发生和进展与血管内皮的损伤、血管内皮功能障碍密切相关。超声检测FMD、GTNMD是目前首选的无创性评价血管内皮功能方法，虽然存在一定的个体、人群差异，国内外大量经超声检测肱动脉FMD、GTNMD的研究认为2型糖尿病、冠心病患者存在明显的血管内皮舒张功能障碍，且部分研究提示可能有遗传因素的作用。 一氧化氮(NO)是已知最重要的内源性血管舒张因子之一，是维持正常血管功能的重要分子，NO产生的减少会导致血管内皮功能障碍，进而促进动脉粥样硬化。在心脏和血管中，NO主要由内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)催化合成。eNOS表达的多少和活性的强弱是NO生成多少的决定因素。NO产生减少的主要机制有：①eNOS基因发生突变，如eNOS基因G894T突变导致产生的eNOS减少或者活性降低；②各种原因导致的eNOS活性下降而其竞争性抑制剂非对称性二甲基精氨酸(ADMA)活性增强等。 其中，在美国、英国、法国等人群中的研究显示eNOS基因G894T多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病(包括心绞痛、心肌梗死等亚型)密切相关，T等位基因携带者发生冠心病的危险明显增加。然而，在印度、土耳其、希腊人群中eNOS基因G894T多态性与冠心病的关系并不密切。此外，亚洲人群中eNOS基因Glu298AspGT/TT基因型和T等位基因频率明显低于欧美人群，体现出明显的人群差异。 本课题拟研究广东汉族人群2型糖尿病和冠心病患者eNOS基因G894T多态性特征，利用超声检测研究对象的FMD、GTNMD以评价其血管内皮舒张功能状况，进一步探讨eNOS基因G894T多态性与血管内皮舒张功能的相关性。 第一部分广东汉族人群2型糖尿病和冠心病患者 eNOS基因G894T多态性的研究 一、研究目的 研究广东汉族人群2型糖尿病和冠心病患者eNOS基因G894T多态性特征，探讨eNOS基因G894T多态性与冠心病发病的关系。 二、研究对象与方法 (一)研究对象 广东籍汉族人群糖尿病和冠心病患者313例，其中男164例，女149例，年龄28～86岁，平均(60.18±11.93)岁。根据有无T2DM或CHD分为三个组： ①2型糖尿病并冠心病组(T2DM+CHD)：同时符合2型糖尿病与冠心病诊断标准，共53例，其中男26例，女27例，年龄40～81岁，平均(66.32±10.44)岁。 ②单纯2型糖尿病组(T2DM)：符合糖尿病诊断标准，但排除冠心病，共181例，其中男91例，女90例，年龄32～85岁，平均(55.21±10.52)岁。 ③冠心病组(CHD)：符合冠心病诊断标准，但排除糖尿病，共79例，其中男47例，女32例，年龄28～86岁，平均(67.46±10.23)岁。 (二)研究方法 1、DNA提取：抽取患者外周静脉全血约2ml，EDTA—Na2抗凝，按“基因组DNA提取试剂盒”说明书的方法提取基因组DNA。 2、目的基因PCR—RFLP分析： ①目的基因PCR扩增：采用25μl反应体系进行30个反应循环，引物为：Primer1：5’—AAG GCA GGA GAC AGT GGA TGGA—3’，Primer2：5’—CCC AGTCAA TCC CTT TGG TGC TCA—3。 ②用限制性内切酶BanⅡ对PCR产物进行酶切。 ③酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，在凝胶成像系统上观察酶切产物的片段大小及数目，判断样本的基因型。 ④酶切产物基因测序：判断目的基因有无突变，并与PCR—RFLP结果进行对照分析。 三、研究结果 1、目的基因PCR—RFLP分析(结果由基因测序证实)： ①基因型为GG时显示163bp和85bp两个片段； ②基因型为GT时显示248bp、163bp和85bp三个片段； ③基因型为TT时显示248bp一个片段。 2、基因多态性分析结果： ①eNOS基因G894T多态性GG、GT、TT和G、T频率： 2型糖尿病并冠心病组71.7％、24.5％、3.8％、84.0％、16.0％：单纯2型糖尿病组86.2％、13.3％、0.6％、92.8％、7.2％；冠心病组73.4％、26.6％、0、86.7％、13.3％。 ②G894T基因型频率、G/T等位基因频率和G894T突变率组间比较：2型糖尿病并冠心病组和冠心病组明显高于单纯2型糖尿病组(P<0.05)，而2型糖尿病并冠心病组与冠心病组之间无显著性差异(P>0.05) ③G/T等位基因携带者冠心病危险分析： T等位基因携带者患冠心病与G等位基因携带者患冠心病的优势比为：OR=2.340(95％CI：1.323-4.138)，P<0.01；将2型糖尿病并冠心病组与单纯2型糖尿病组合并分析，2型糖尿病患者中T等位基因携带者患冠心病与G等位基因携带者患冠心病的优势比为：OR=2.463(95％CI：1.185～5.120)，P<0.05。 四、研究结论 eNOS基因G894T多态性中GT/TT基因型和T等位基因是本组病例中冠心病的危险因素，eNOS基因G894T突变能够增加冠心病的发病危险。在2型糖尿病患者中，eNOS基因G894T突变同样能够增加2型糖尿病患者的冠心病发病危险。 第二部分广东汉族人群2型糖尿病和冠心病患者血管内皮舒张功能的超声研究 一、研究目的 评价广东汉族人群2型糖尿病和冠心病患者eNOS基因G894T多态性GT型与GG型之间的FMD和GTNMD，探讨eNOS基因G894T多态性与血管内皮功能障碍的关系。 二、研究对象与方法 (一)研究对象 对前述313例患者中的175例进行了肱动脉血管内皮功能超声检测，其中男95例，女80例，年龄32～79岁，平均(55.25±10.91)岁。其余128例(包括3例TT型患者)因各种原因未能进行血管内皮功能检测。根据eNOS基因G894T基因型分为两组，两组患者一般资料之间的差异无统计学意义。 ①GG组：共141例，男75例，女66例，年龄32～79岁，平均(55.4±10.9)岁 ②GT组：共34例，男20例，女14例，年龄28～78岁，平均(54.6±11.0)岁 (二)研究方法——高频超声无创性检测FMD和GTNMD 1、仪器和试剂：①GE Logic—9型超声诊断仪，7-14MHz线阵探头；②血压计；③硝酸甘油片(0.5mg/片)。 2、肱动脉内皮舒张功能检测方法：参照Celermager等报告的方法。 (1)测量内容： ①基础状态下肱动脉内径(D0)：患者于室温22～25℃下平卧至少10min后测量，记为D0； ②反应性充血后肱动脉内径(D1)：将血压带置于肘上5cm以上的右上臂，充气加压到280mmHg左右，持续5min，迅速减压至0mmHg，减压后约60s～90s时测量肱动脉内径，记为D1； ③恢复后内径(D2)：休息约15min～30min后测量恢复后内径，记为D2； ④舌下含服硝酸甘油后内径(D3)：舌下含服硝酸甘油0.5mg，以硝酸甘油片完全融化为准，5min后再重复上述测量，记为D3。 (2)计算方法： ①FMD=(D1-D0)/D0×100％ ②GTNMD=(D3-D2)/D2×100％ 三、研究结果 1、GG型与GT型患者的FMD分别为：(18.15±7.33)％和(14.94±6.19)％，GTNMD分别为：(22.93±9.23)％和(19.42±7.13)％；GG组与GT组FMD、GTNMD之间的差异具有统计学意义(P<0.05)，GT组FMD和GTNMD较GG组差。 2、单因素分析及多重回归分析均显示FMD、GTNMD与eNOS基因G894T分型显著相关。 四、研究结论 FMD和GTNMD与eNOS基因G894T多态性相关，GT型患者的FMD和GTNMD均较GG型患者受损明显。 全文结论： ①在本研究的广东汉族人群2型糖尿病和冠心病患者中，eNOS基因G894T多态性中GG型占80.5％、GT型占18.5％、TT型占1.0％，突变率(GT型+TT型)为19.5％；G等位基因频率为89.8％，T等位基因频率10.2％； ②eNOS基因G894T多态性中GT/TT基因型和T等位基因是本组病例中冠心病的独立危险因素； ③FMD和GTNMD与eNOS基因G894T多态性相关；GT型患者的FMD和GTNMD均较GG型患者受损明显。