背景:从各种人体组织和器官中可以分离出被称为间充质基质/干细胞（Mesenchymal stromal/stem cells,MSCs）的多能祖细胞,近10年其研究发展迅速,为细胞治疗和再生医学领域的发展提供了源源不断的动力。研究最广泛的MSCs来源包括骨髓、脂肪、脐带和胎盘等。国际细胞治疗协会（International Society for Cellular Therapy,ISCT）对MSCs制定了最低标准,包括细胞能够粘附在塑料皿上,并表达相应的分化簇（CD）标记（例如CD73、CD90和CD105标记）,并且可以在体外进行成脂,成软骨和成骨分化。MSCs的细胞治疗效能主要体现在分化潜能和免疫调剂能力上,特别是免疫调节能力让其在全身多个系统的炎性疾病中都显示出不俗的疗效。羊水中也能分离出与MSCs生物学特性高度一致的细胞,通常被定义为羊水间充质干细胞（Amniotic fluid mesenchymal stem cells,AFMSCs）或羊水来源干细胞（Amniotic fluid stem cells,AFSCs）。一般认为AFSCs介于胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）和MSCs之间的中间阶段细胞,比起传统的MSCs具有更多良好的生物学特,如相比骨髓和脂肪来源的MSCs有更快增殖速度、更广泛的分化潜能、更强的免疫调节能力等。然而AFSCs具有显著的异质性,许多报道表明了AFSCs在细胞形态、分子表型和分化能力等多个方面存在不稳定性。细胞异质性带来的生物学特性的差异,在体外细胞增殖的过程中会进一步把这种差异扩大,进而影响临床细胞治疗效果的稳定性。而AFSCs异质性主要是因为其存在不同的组织器官来源,有研究指出羊水细胞中可以检测出骨髓、皮肤、肾、肝、肺、心等组织器官的特异性标记物。现今为止虽然已经有研究分离了不同组织特异性的AFSCs,但未对其进行深入的生物学特性检测以及临床治疗效能的评估。为此我们拟分离不同组织特异性的AFSCs,从多个角度的评估其生物学特性差异和治疗效能,为解决AFSCs异质性提供可行的思路,为AFSCs临床治疗应用提供更全面深入的理论基础。第一部分不同培养方法分离羊水来源的干细胞及其生物学特性分析目的:建立合适的AFSCs原代和传代培养方案,评估其生物学特性,同时与脐带间充质干细胞进行比较,为后续研究奠定实验基础。方法:1.建立三种培养模式,商品化培养基进行原代和传代培养（AFC）,传统间充质干细胞进行原代和传代培养（MSC）,以及商品化培养基进行原代培养和传统间充质干细胞进行传代培养（AFC-MSC）;2.通过克隆形成实验、CCK-8实验、群体倍增时间检测评估不同培养途径的培养效率;3.流式细胞仪检测细胞表面CD标志物;4.对不同培养途径获得的细胞进行成骨、成脂、成软骨分化,组织特异性染色和分化标志物基因的表达评估分化效果;5.把细胞与激活的外周血单个核细胞（PBMCs）进行共培养,通过CFSE增殖定量分析、增殖标记蛋白的表达及促炎因子的表达评估细胞对PBMCs的抑制能力。结果:1.三种培养途径均能获得AFSCs细胞,但AFC培养途径效率更高,而MSC培养途径更廉价,AFC-MSC培养效率和成本处于两者之间;2.不同培养途径获得的AFSCs在在CD105的表达上存在差异,但不影响细胞形态、多能性基因的表达、分化潜能和免疫抑制能等主要生物学特性;3.与UCMSCs比较,AFSCs具有更高的成骨和成软骨分化能力,更强的免疫调节能力。结论:三种培养途径均可有效获得的AFSCs,CD105表达的差异不影响其他主要生物学特性,并具有比UCMSCs更强的分化潜能和免疫抑制能力。综合考虑时间和资金成本,选择AFC-MSC培养途径更合适。第二部分分离不同组织特异性的羊水来源干细胞并进行生物学特性分析目的:分离出不同组织特异性的AFSCs,从细胞形态、增殖能力、分子表型、多能性基因的表达、分化能力、迁移能力和免疫抑制能力等多个方面分析其差异。方法:1.通过机械挑克隆的方法分离出单个细胞形成的克隆并传代;2.对分离的克隆进行组织标记基因的检测,鉴定出不同组织特异性的AFSCs;3.显微镜下观察细胞形态,群体倍增时间分析增殖能力,β-半乳糖苷酶染色及细胞周期调控标志基因分析衰老程度;4.免疫荧光定性分析胚胎干细胞因子的表达,流式细胞仪定量分析细胞抗原决定簇和多能性因子的表达;5.进行成骨、成脂、成软骨分化,通过分化特异性染色的定性、定量分析及检测分化标志物基因的表达来评估分化程度;6.划痕实验、Transwell实验及检测迁移能力和趋化能力的标志基因评估细胞迁移能力;7.把细胞与激活的PBMCs共培养,通过CFSE细胞增殖实验、增殖标记蛋白的表达和促炎因子基因的表达评估细胞对PBMCs的抑制能力。结果:1.从中孕期羊水分离的AFSCs能表达肺和肾组织特异性标记物,通过分离单细胞克隆并进行鉴定,可以分离出肾特异性AFSCs（AFSCs-K）、肺特异性AFSCs（AFSCs-L）和未知组织特异性AFSCs（AFSCs-X）;2.相比其他两组,AFSCs-K具有更快的增殖速率,更高的CD90、CD105和CD117的表达水平,更好的中胚层三系分化能力和更强的免疫抑制能力。但AFSCs-K具有更强的水平和垂直迁移能力,表达更多的迁移标志物基因,AFSCs-L则表达更多的趋化因子受体。3.分离后的不同组织特异性的AFSCs的各项生物学指标如细胞形态、增殖能力、分子表型、分化潜能等一致性更高,异质性大幅度降低。结论:AFSCs中可以分离出不同组织特异性的细胞,其生物学特性存在差异,总体上AFSCs-X的特性更优。按组织特异性分离后的细胞异质性大幅下降,细胞的各项指标更趋一致。分离不同组织特异性的AFSCs是解决细胞异质性的可行方案第三部分不同组织特异性的羊水来源干细胞对脓毒血症小鼠治疗效能目的:评估不同组织特异性的AFSCs在脓毒血症小鼠模型中的治疗效能。方法:1.使用盲肠穿刺法构建脓毒血症小鼠模型;2.对小鼠进行生存分析,构建生存曲线;3.对血液和腹腔液进行细菌培养,评估AFSCs的抗菌效能;4.Elisa分析血液中促炎因子的表达情况,评估AFSCs的抗炎效能。结果:1.不同组织特异性的AFSCs均能显著改善脓毒血症小鼠的存活率;2.不同组织特异性的AFSCs均能协助机体清除体内细菌,但以AFSCs-X的效果更为显著;3.相比AFSCs-L,AFSCs-K和AFSCs-X更能抑制促炎因子的表达,但两组之间无明显差异。结论:总体上AFSCs能改善脓毒血症生存率,具有抗菌抗炎的效果,其中以AFSCs-X的效果更为明显。