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背景:肝纤维化是慢性肝病的共同途径,一旦损伤因素持续存在,则会发展为肝硬化、肝癌,甚至导致死亡。早期肝纤维化是可以被逆转的,但是具体机制还未完全明确。所以,对肝纤维化的机制进行探究,有望发现潜在的治疗靶点。已知NOX2和NLRP3炎症小体在肝纤维化过程中起着关键作用,但是两者在肝纤维化的相互调控机制仍未明确。肠道内含有数量庞大且种类繁多的微生物群,参与机体多种活动,与疾病发展也密切相关。已有研究表明NOX2和NLRP3炎症小体会通过肠道菌群来调节疾病的进展。熊果酸（Ursolic acid,UA）是一种存在于中药植物中的单体化合物,早期研究表明其有抗炎、抗肝纤维化作用,但是具体机制仍未完全阐明。课题组前期利用NOX2、NLRP3炎症小体的抑制剂,发现UA可通过抑制NOX2/NLRP3炎症小体信号通路改善CCl4造模小鼠肝纤维化,并在体外实验中发现UA可通过NOX2/NLRP3炎症小体信号通路抑制KCs活化与焦亡。本研究进一步丰富了肝纤维化小鼠造模方式,并利用NOX2和NLRP3基因敲除小鼠,体内实验深入探究UA抑制肝纤维化的具体分子机制及对肠道菌群的影响,为UA治疗肝纤维化提供更有利的依据。目的:1.阐明NOX2与NLRP3炎症小体在肝纤维化中相互调控的关系,及UA是否通过抑制NOX2/NLRP3炎症小体信号通路进而发挥抗肝纤维化作用。2.观察小鼠肝纤维化时肠道菌群的变化,探究UA是否通过抑制NOX2/NLRP3炎症小体信号通路,进而改善肠道菌群,从而逆转肝纤维化。方法:1.野生型C57BL/6小鼠、NOX2基因敲除(NOX2-/-)小鼠和NLRP3基因敲除(NLRP3-/-)小鼠分别采用两种方式造模。MCD肝纤维化小鼠模型:空白对照组小鼠给予MCS饮食8周;MCD组小鼠给予MCD饮食8周;UA组小鼠给予MCD饮食8周,其中后4周同时给予50mg/kg的UA灌胃处理,每周7次。CCl4肝纤维化小鼠模型:空白对照组小鼠腹腔注射橄榄油8周,1ml/kg,每周两次;CCl4组小鼠腹腔注射20%CCl4（橄榄油稀释）8周,1ml/kg,每周2次;UA组小鼠腹腔注射20%CCl4（橄榄油稀释）8周,1ml/kg,每周2次,其中后4周同时给予50mg/kg的UA灌胃处理,每周7次。2.HE、天狼猩红染色和Masson染色观察肝脏组织病理结构。3.ELISA试剂盒检测小鼠的ALT、AST、羟脯氨酸。4.WB检测肝组织α-SMA、Collagen I、TIMP1、NOX2、NLRP3炎症小体的蛋白含量。5.实时荧光定量PCR检测肝组织α-SMA、Collagen I、TIMP1、NOX2、NLRP3炎症小体的m RNA表达。6.16S r RNA测序检测肠道菌群。结果:1.NOX2和NLRP3炎症小体在MCD造模小鼠肝脏中的表达以及UA的治疗作用1.1 UA减轻MCD造模小鼠的肝脏损伤和纤维化与对照组（MCS组）相比,MCD组小鼠肝脏结构被破坏,脂质积累严重,炎症细胞浸润明显增多,胶原沉积增多,肝纤维化评分更高;与MCD组相比,UA组小鼠肝脏中脂质积累减轻,炎症细胞浸润减少,胶原沉积变少,肝纤维化评分降低。1.2 UA治疗减轻MCD造模小鼠的肝功能损害和羟脯氨酸水平和MCS组相比,MCD组小鼠血清中AST、ALT水平及羟脯氨酸水平升高;UA组小鼠血清中AST较MCD组下降,ALT和羟脯氨酸水平也明显降低。1.3 UA抑制MCD造模小鼠的NOX、NLRP3炎症小体及肝纤维化相关指标的表达与MCS组相比,MCD组小鼠肝脏组织中α-SMA、TIMP1、Collagen I、NOX2和NLRP3炎症小体蛋白表达量更高;UA组和MCD组相比,小鼠肝脏中α-SMA、TIMP1、Collagen I、NOX2、NLRP3炎症小体的蛋白表达量更低。相似的,与MCS组相比,MCD组小鼠肝脏中Collagen I、α-SMA、TIMP1、NOX2和NLRP3炎症小体的m RNA表达水平上升,UA治疗后这些指标m RNA表达均下调。2.NOX2和NLRP3炎症小体在CCl4造模小鼠肝脏中的表达以及UA的治疗作用2.1 UA减轻CCl4造模小鼠的肝脏损伤和纤维化与空白对照组（Control组,Con组）相比,CCl4组小鼠肝脏结构紊乱且胶原纤维沉积增多,肝纤维化评分增加;与CCl4组相比,UA组小鼠肝纤维化情况好转。2.2 UA治疗减轻CCl4造模小鼠的肝功能损害和羟脯氨酸水平与Control组相比,CCl4组小鼠血清中AST、ALT和羟脯氨酸水平明显提高;与CCl4组相比,UA组小鼠血清中AST水平降低,ALT和羟脯氨酸水平也降低。2.3 UA抑制CCl4造模小鼠的NOX2、NLRP3炎症小体及肝纤维化相关指标的表达与Control组相比,CCl4组小鼠肝脏中α-SMA、Collagen I、TIMP1蛋白表达量更高;同时,CCl4组小鼠肝脏中NOX2、NLRP3炎症小体蛋白表达量更高。与CCl4组相比,UA组小鼠肝脏中α-SMA、Collagen I、TIMP1的蛋白表达量显著下降,NOX2、NLRP3炎症小体蛋白表达量也更低。同时,CCl4组小鼠肝脏中α-SMA、TIMP1、Collagen I、NOX2和NLRP3炎症小体的m RNA表达高于Control组,UA治疗后这些指标的表达水平都下降。3.UA通过调控NOX2/NLRP3炎症小体信号通路改善肝纤维化3.1 UA通过调控NOX2缓解MCD造模小鼠的肝纤维化3.1.1 UA对NOX2-/-的MCD造模小鼠肝脏损伤和纤维化的影响与MCD组相比,NOX2-/-+MCD组小鼠肝脏中脂质积累情况明显好转,肝脏结构破坏较少,胶原沉积减少,炎症细胞浸润减少。NOX2-/-+MCD组和NOX2-/-+MCD+UA组之间没有明显差异。3.1.2 UA对NOX2-/-的MCD造模小鼠肝功能和羟脯氨酸水平的影响和MCD组相比,NOX2-/-+MCD组小鼠血清中AST、ALT水平明显降低,羟脯氨酸水平下降。NOX2-/-+MCD组和NOX2-/-+MCD+UA组之间没有明显差异。3.1.3 UA对NOX2-/-的MCD造模小鼠肝纤维化相关指标和NLRP3炎症小体的影响与MCD组相比,NOX2-/-+MCD组小鼠肝脏组织中α-SMA、Collagen I、TIMP1、NOX2的蛋白和m RNA表达下调;同时,NOX2-/-+MCD组中NLRP3炎症小体的蛋白和m RNA表达量也更低。与NOX2-/-+MCD组相比,NOX2-/-+MCD+UA组各个指标的蛋白和m RNA水平无显著差异。3.2 UA通过调控NOX2缓解CCl4造模小鼠的肝纤维化3.2.1 UA对NOX2-/-的CCl4造模小鼠肝脏损伤和纤维化的影响与CCl4组相比,NOX2-/-+CCl4组小鼠肝脏结构紊乱、纤维间隔形成减少,胶原纤维沉积显著减少。NOX2-/-+CCl4组和NOX2-/-+CCl4+UA组间无显著差异。3.2.2 UA对NOX2-/-的CCl4造模小鼠肝功能和羟脯氨酸水平的影响和CCl4组相比,NOX2-/-+CCl4组小鼠血清中羟脯氨酸水平明显下降,AST和ALT水平也显著降低。NOX2-/-+CCl4组和NOX2-/-+CCl4+UA组间转氨酶和羟脯氨酸的水平无显著差异。3.2.3 UA对NOX2-/-的CCl4造模小鼠肝纤维化相关指标和NLRP3炎症小体的影响与CCl4组相比,NOX2-/-+CCl4组小鼠肝脏组织中α-SMA、Collagen I、TIMP1、NOX2的蛋白和m RNA表达量显著降低;同时,NOX2-/-+CCl4组中NLRP3炎症小体的蛋白和m RNA表达量也显著降低。与NOX2-/-+CCl4组相比,NOX2-/-+CCl4+UA组各个指标的蛋白和m RNA水平无显著差异。3.3 UA通过调控NLRP3炎症小体缓解MCD造模小鼠的肝纤维化3.3.1 UA对NLRP3-/-的MCD造模小鼠肝脏损伤和纤维化的影响与造模组MCD组相比,NLRP3-/-+MCD组小鼠肝脏中脂质积累及炎症浸润情况明显好转,纤维间隔及胶原沉积减少,肝纤维化评分更低。NLRP3-/-+MCD组与NLRP3-/-+MCD+UA组小鼠肝脏纤维化情况并无统计学差异。3.3.2 UA对NLRP3-/-的MCD造模小鼠肝功能和羟脯氨酸水平的影响和MCD组相比,NLRP3-/-+MCD组小鼠血清中AST、ALT水平明显降低,羟脯氨酸水平也降低。与NLRP3-/-+MCD组相比,NLRP3-/-+MCD+UA组小鼠血清中AST、ALT水平下降,羟脯氨酸也减少,但两组间的差异不具统计学意义。3.3.3 UA对NLRP3-/-的MCD造模小鼠肝纤维化相关指标和NOX2的影响与MCD组相比,NLRP3-/-+MCD组小鼠肝脏组织中α-SMA、TIMP1、Collagen I和NLRP3炎症小体的蛋白表达下调,NOX2的蛋白表达无显著差异。与NLRP3-/-+MCD组相比,NLRP3-/-+MCD+UA组小鼠肝脏组织中NOX2的蛋白表达下调。q PCR实验检测相同指标的m RNA水平,结果与WB实验相似。3.4 UA通过调控NLRP3炎症小体缓解CCl4造模小鼠的肝纤维化3.4.1 UA对NLRP3-/-的CCl4造模小鼠肝脏损伤和纤维化的影响与CCl4组相比,NLRP3-/-+CCl4组小鼠肝脏结构紊乱、纤维间隔形成减少,胶原纤维沉积显著减少。与NLRP3-/-+CCl4组相比,UA干预之后纤维化情况好转,但这两组间并无统计学差异。3.4.2 UA对NLRP3-/-的CCl4造模小鼠肝功能和羟脯氨酸水平的影响和CCl4组相比,NLRP3-/-+CCl4组小鼠血清中AST、ALT和羟脯氨酸水平明显下降。与NLRP3-/-+CCl4组相比,NLRP3-/-+CCl4+UA组小鼠血清中AST、ALT和羟脯氨酸水平降低,但是差异没有统计学意义。3.4.3 UA对NLRP3-/-的CCl4造模小鼠肝纤维化相关指标和NOX2的影响与CCl4组相比,NLRP3-/-+CCl4组小鼠肝脏组织中α-SMA、TIMP1、Collagen I和NLRP3炎症小体的蛋白表达下调,但是NOX2的蛋白表达量无明显变化。与NLRP3-/-+CCl4组相比,NLRP3-/-+CCl4+UA组小鼠肝脏组织中NOX2的蛋白表达下调。q PCR实验检测相同指标的m RNA水平,结果与WB实验相似。4.UA可以调节肝纤维化期间肠道菌群,且该作用可能与NOX2/NLRP3炎症小体信号通路相关4.1 UA对MCD造模小鼠肠道菌群多样性和组成的影响与MCS组相比,MCD组的菌群α多样性降低;与MCD组相比,UA组的α多样性显著恢复。β多样性分析结果显示:MCS组、MCD组和UA组各组组内样品接近,分组效果好。三组的微生物群落组成具有差异。在门水平上:与MCS组相比,MCD组造模小鼠肠道中厚壁菌门（Firmicutes）增多,拟杆菌门（Bacteroidota）减少;与MCD组相比,UA治疗后,小鼠肠道内Firmicutes减少,Bacteroidota出现回升。在属水平:与MCS组相比,MCD组纤维化小鼠肠道内Akkermansia增多;UA治疗后Akkermansia丰度下降。4.2 NOX2-/-对MCD造模小鼠的肠道菌群多样性和组成的影响与MCD组相比,NOX2-/-+MCD组（X组）的菌群α多样性升高;NOX2-/-+MCD组与NOX2-/-+MCD+UA组（U组）间α多样性无统计学差异。β多样性分析结果显示:MCD组、NOX2-/-+MCD组和NOX2-/-+MCD+UA组各组组内样品接近,分组效果好。在门水平:与MCD组相比,NOX2-/-+MCD+UA组小鼠肠道中的Firmicutes减少、Bacteroidota增多。在属水平:NOX2-/-+MCD组小鼠肠道中Helicobacter低于MCD组小鼠。NOX2-/-+MCD+UA组小鼠肠道内Helicobacter也低于MCD组。4.3 NLRP3-/-对MCD造模小鼠肠道菌群多样性和组成的影响NLRP3-/-+MCD组的菌群α多样性比MCD组高;与NLRP3-/-+MCD组相比,NLRP3-/-+MCD+UA组的α多样性无统计学差异。β多样性分析结果显示:MCD组、NLRP3-/-+MCD组和NLRP3-/-+MCD+UA组各组组内样品接近,分组效果好。在门水平上:与MCD组相比,NLRP3-/-+MCD+UA组小鼠肠道中Firmicutes减少、Bacteroidota增多。在属水平:NLRP3-/-+MCD组小鼠中Helicobacter低于MCD肝纤维化小鼠;NLRP3-/-+MCD+UA组小鼠肠道内Helicobacter也低于MCD组。结论:1.在肝纤维化的发展中,NOX2作为上游调控NLRP3炎症小体,UA通过抑制NOX2/NLRP3炎症小体信号通路发挥抗肝纤维化作用。2.UA可能通过干预NOX2/NLRP3炎症小体信号通路,进而改善肠道菌群,从而抑制肝纤维化。