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血管基质成分(SVF)是从脂肪组组中分离出来的细胞群,目前已广泛应用于组织再生领域。SVF中含有造血干/祖细胞,但数量少并且归巢能力低。在目前造血干细胞供者来源困难的情况下,如何对SVF中的造血干/祖细胞进行有效扩增,提高其归巢能力,是亟需解决的重要问题。脂肪间充质干细胞(adipose derived stromal cells,ADSCs)是一种多能干细胞,可促进移植后的造血重建。然而ADSCs的安全性限制了其在临床的广泛应用。脂肪间充质干细胞来源的外泌体(exosomes)是ADSCs释放到细胞外基质的膜性囊泡。exosomes介导的旁分泌机制在ADSCs为基础的治疗中发挥作用。因此本课题拟探讨ADSC-exsomes对SVF中造血细胞增殖和归巢的作用,为SVF的临床应用提供理论依据,同时为造血功能损伤修复治疗提供新的思路。方法:1.I型胶原酶摇床消化人脂肪组织,分离获取SVF,免疫磁珠分选SVF-CD34+细胞。通过流式细胞表型分析、造血干细胞集落培养、脾集落证实S VF-CD34+细胞的造血功能。2.贴壁培养法分离纯化ADSCs,鉴定其表型和功能型鉴定。运用超滤法和密度梯度离心法从第3代ADSCs中分离ADSCs-exosomes。通过透射电镜形态学、纳米颗粒可视性分析系统、Western Blot检测exosomes表面标志性蛋白对ADSC-exosomes 进行鉴定。3.ADSC-exosomes与SVF-CD34+细胞共培养,不同时间点检测细胞总数、CD34+细胞比例、细胞周期及造血干细胞集落,探讨ADSCs-exosomes对细胞增殖的影响。SVF-CD34+细胞用CM-DIL标记,与ADSC-exosomes共同植入TBI的NOD/SCID小鼠,荧光显微镜下观察SVF-CD34+细胞在骨髓腔和外周器官的定位,流式细胞检测骨髓腔内荧光标记细胞数,荧光定量PCR检测移植前后骨髓单个核细胞中CXCR4mRNA表达水平,探讨ADSCs-exosomes对SVF-CD34+细胞归巢的作用。4.ADSC-exosomes与SVF-CD34+共同植入,通过生存分析、血常规监测、骨髓常规、GVHD评估、流式细胞hCD45比例等指标探讨ADSC-exosomes是否有助于SVF-CD34+细胞的造血重建。研究结果:1.人脂肪组织中分离的SVF-CD34+细胞具有造血干/祖细胞的免疫表型和功能型。2.超滤法结合密度梯度离心法成功分离ADSC-exosomes。透射电子显微镜显示ADSC-exosmes是一群圆形或椭圆形膜性小囊泡,有完整胞膜,直径分布在76nm左右,exosomes相关蛋白CD63、CD9、CD81呈阳性表达,这些结果均符合exosomes的特性。3.ADSC-exosomes 与 SVF-CD34+共培养后,ADSC-exosomes 对 SVF-CD34+细胞的增殖呈浓度依赖性,随浓度增加增殖作用增强。共培养7天仍有足够的细胞处于分裂前期,有助于维持其干细胞特性。ADSC-exosomes能增加SVF-CD34+细胞CXCR4mRNA表达水平。体内实验证实ADSC-exosomes共移植可以使更多的SVF-CD34+细胞有效归巢至骨髓腔。实时定量PCR结果显示SDF-1、CXCR4基因转录水平较移植前升高。4.ADSC-exosomes与SVF-CD34+细胞共移植的NOD/SCID小鼠,血常规恢复时间较单独移植SVF-CD34+细胞组缩短,骨髓和脾脏中有更高比例的人源细胞植入。结论:1.本研究成功建立了从人脂肪组织中分离获取SVF-CD34+细胞的方法,并证实SVF-CD34+细胞的造血潜能。2.利用超滤法结合蔗糖密度梯度离心法可以从ADSCs细胞培养上清中可以获得高纯度的外泌体样本。3.ADSC-exosomes支持SVF-CD34+细胞的体外增殖,提高SVF-CD34+细胞的CXCR4 mRNA表达水平。4.体内实验证实了 ADSC-exosomes有助于SVF-CD34+细胞的有效归巢及移植后的造血重建,相关机制可能与调节SDF-1/CXCR4信号通路相关。这将为SVF在造血干细胞移植领域的临床应用提供实验依据,同时也为SVF-CD34+细胞体外有效扩增提供了新的途径和解决方法。