背景与目的脑血管病是当今我国致死致残的首要原因,其中缺血性脑卒中(Acute ischemic stroke,AIS)占87%,然而目前AIS的治疗方法十分有限。脑血管病对患者本人及其家庭,以及整体社会经济带来严重影响,因此进一步了解AIS发生发展的机制,寻找新的潜在治疗靶点迫在眉睫。新近研究揭示,卒中后炎症在AIS中具有双重作用,一方面在AIS急性期促进组织损伤的进一步加重,另一方面在组织修复阶段促进脑组织与神经功能的恢复。因此,在AIS急性期进行免疫调节以防止缺血性损伤加重或将为AIS急性期治疗提供新的思路。Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)是免疫反应的关键分子之一。在卒中后炎症中,TLR4通过引起下游炎症瀑布从而在天然免疫反应中起重要作用,同时也是连接天然免疫与特异性免疫的桥梁。抑制TLR4在缺血性脑卒中动物模型中被证实具有减少梗死体积和改善神经功能缺损的作用,这提示调节TLR4或可通过减缓卒中后炎症减轻脑组织缺血性损伤。MicroRNA调节中枢神经系统30%左右的基因表达。研究发现,AIS可引起多种microRNA水平的显著变化,且microRNA在AIS病理进程中起到关键调节作用,是目前AIS研究的热点之一。然而,目前尚无关于AIS后microRNA对TLR4的靶向性调节的研究报道。本研究主要侧重于TLR4在microRNA 水平的转录后调节,及其对卒中后炎症和AIS的影响。方法本研究采用小鼠大脑中动脉闭塞模型(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)和细胞糖氧剥夺(Oxygen-glucose deprivation,OGD)模型作为AIS体内与体外研究模型。通过microRNA芯片与聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)筛选MCAO后小鼠脑组织内表达出现差异的microRNA。通过生物信息学分析结合荧光素酶报告基因系统确定能对TLR4进行特异性调节的microRNA。通过PCR和原位杂交观测该microRNA在MCAO小鼠缺血半球梗死核心与梗死周边带的时间与空间分布变化。在体外培养的原代神经元、星型胶质细胞和小胶质细胞中分别给予该microRNA的抑制剂与模拟物,通过免疫蛋白印记(Western blotting,WB)和免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测TLR4表达水平。通过立体定位注射技术经侧脑室给予microRNA的抑制剂与模拟物,通过WB与IF检测小鼠MCAO后TLR4表达水平,PCR检测炎症因子表达变化,采用磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)计算梗死体积,组织冰冻切片苏木素-伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色,Fleoro-Jade C染色,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(Terminal dexynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)观测脑组织损伤,改良的神经功能缺损严重程度量表(modified neurological severity score,mNSS)评估小鼠神经功能。结果(1)结合TargetScan和miRanda数据库的生物信息学分析,microRNA芯片和PCR的检测,以及荧光素酶报告基因系统的验证,确定microRNA-1906特异性识别TLR4信使RNA(Messenger RNA,mRNA)的3端非翻译区(3’-untranslated region,3’ UTR),从而抑制 TLR4 的表达。(2)在小鼠 MCAO模型中,TLR4在mRNA水平与蛋白水平的表达出现不匹配,mRNA随时间逐渐上升,而TLR4蛋白在第2小时上升,第4小时起恢复到基线水平,同时实验组的microRNA-1906从第2小时起显著高于对照组,原位杂交结果显示microRNA-1906主要聚集于梗死周边带。(3)给予人工合成的microRNA-1906模拟物可以降低体外培养的原代神经元、星型胶质细胞和小胶质细胞OGD后TLR4的表达水平。(4)体内实验同样证实,microRNA-1906模拟物可以抑制TLR4蛋白表达,减少促炎性炎症因子表达,降低梗死体积,减轻组织损伤,并减轻神经功能缺损严重程度,而给予microRNA-1906抑制剂则能增加TLR4蛋白表达。结论本研究发现microRNA-1906是TLR4的一种新的调节因子,并证实对小鼠给予microRNA-1906模拟物可以通过下调TLR4蛋白水平,减轻急性期卒中后炎症反应,从而改善MCAO引起的缺血性脑组织损伤与神经功能缺损。