碘化N-正丁基氟哌啶醇对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制和Ca2+/PKC信号通路在心肌细胞缺氧复氧Egr-1表达中的作用

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Egr-1是即早基因家族的一员,能在众多刺激因素的作用下快速表达,介导细胞对外界环境改变的反应。Egr-1在心脏排斥反应,肺缺血再灌注(I/R)损伤中起到了中心性的作用。但Egr-1在心肌缺血再灌注中的作用尚未明确,故而课题组应用Egr-1反义寡核苷酸在整体和离体两方面观察了Egr-1在心肌缺血再灌注及心肌细胞缺氧复氧(H/R)中的作用。发现Egr-1在心脏I/R及心肌细胞H/R中起到了非常重要的作用。课题组合成的化合物碘化N-正丁基氟哌啶醇(F2)能够抑制缺血再灌注心肌Egr-1mRNA及蛋白的表达,同时观察到了心脏功能的改善。可见F2可通过抑制Egr-1mRNA及蛋白的表达起到拮抗心肌I/R损伤的作用。那么F2通过抑制Egr-1表达,减轻I/R损伤的作用是否是F2所用作用机制呢?先前的研究已经表明Egr-1在心肌I/R中起到了非常重要的作用,有研究发现作为细胞内重要的信使Ca2+、PKC参与了对Egr-1的调控。然而,有关Egr-1在心肌I/R下高表达的分子机制尚未明确。因此本研究主要围绕二个方面进行探讨:①在应用Egr-1反义寡核苷酸的基础上加用F2,通过观察Egr-1蛋白表达及心脏功能的变化来探讨这一问题。②采用原代培养的心肌细胞H/R模型,运用离体心肌细胞H/R损伤模拟在体心肌I/R损伤,应用维拉帕米,PKC抑制剂H7、BIM探讨Ca2+/PKC信号通路在心肌细胞Egr-1表达中的作用。方法1.心肌缺血再灌注模型的建立及实验分组:手术结扎大鼠冠状动脉左前降支造成心肌缺血60min后解除结扎再灌注180min。大鼠随机分成五组:对照(Control)组、缺血再灌注(I/R)组、溶剂(PEG)组、反义寡核苷酸(AS)组、反义寡核苷酸+F2(AS+F2)组。实验结束后,取结扎线下缺血心肌组织,用Western blot法测定心肌组织中Egr-1蛋白表达情况;比色法测定大鼠血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)的活性和大鼠心肌组织髓过氧化物酶(MPO)的活性;硫代巴比妥酸法测定心肌组织丙二醛(MDA)的含量;黄嘌呤氧化酶法测定心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)的活性。实验过程中监测血流动力学,全程记录心率(HR)、收缩压(SP)、舒张压(DP)、左心室收缩压(LVSP)、左心室压变化速率最大值(±dp/dtmax)。2.心肌细胞缺氧复氧模型的建立及实验分组:进行原代心肌细胞培养,细胞生长至5-7d后,对其进行随机分组:对照(Control)组、缺氧复氧(H/R)组、溶剂(DMSO)组、EGTA组、维拉帕米(VER)组、H7组和BIM组。H/R组细胞先换用被高纯度氮气饱和的缺氧液,置于缺氧箱中37℃密闭培养3h,后又继续在正常培养基中按常规培养条件培养1h,造成H/R损伤。RT-PCR法检测培养心肌细胞中Egr-1mRNA的表达水平。Western-blot法检测培养心肌细胞中Egr-1蛋白的表达水平。结果1.AS、AS+F2对Egr-1蛋白水平的影响与Control组比,I/R组Egr-1蛋白表达明显增强(P<0.05);与I/R组比,AS组及AS+F2组Egr-1蛋白表达明显减弱(P<0.05)。AS+F2组与AS组比无统计学意义(P>0.05)。2.AS、AS+F2对心肌组织中MPO、SOD活性和MDA含量的影响与I/R组比,AS、AS+F2能有效降低缺血再灌注心肌组织中MPO的活性(P<0.05),MDA的含量(P<0.05),保护SOD的活性(P<0.05)。AS+F2组与AS组比有统计学意义(P<0.05)。3.AS、AS+F2对血清中LDH、CK活性的影响与Control组比,I/R组血清中LDH、CK的活性明显提高(P<0.05)。与I/R组比,AS组、AS+F2组心肌酶的释放明显降低(P<0.05)。与AS组比,AS+F2组心肌酶的释放明显降低。4.AS、AS+F2对血流动力学的影响缺血期,各组HR、SP、DP、LVSP、±dp/dtmax均降低,与I/R组比,AS组及AS+F2组有统计学意义(P<0.05),AS+F2组与AS组比无统计学意义(P>0.05):再灌注时,与I/R组比,AS组和AS+F2组有统计学意义(P<0.05),AS+F2组与AS组比,有统计学意义(P<0.05)。5.VER、EGTA、H7、BIM对缺氧复氧心肌细胞Egr-1表达的影响5.1.VER、EGTA、H7、BIM对培养心肌细胞Egr-1 mRNA表达水平的影响:RT-PCR结果显示:与Control组相比,H/R组及DMSO组心肌细胞Egr-1mRNA的表达水平明显增高;与H/R组比,VER组、EGTA组、H7组、BIM组Egr-1 mRNA的表达明显下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.2.VER、EGTA、H7、BIM对培养心肌细胞Egr-1蛋白表达水平的影响:Western blot结果显示:与Control组相比,H/R组及DMSO组心肌细胞Egr-1mRNA的表达水平明显增高;与H/R组比,VER组、EGTA组、H7组、BIM组Egr-1蛋白的表达明显下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1)F2能通过抑制Egr-1的过量表达起到抗心肌缺血再灌注的作用:F2除通过抑制Egr-1起到抗心肌缺血再灌注损伤外还有其它机制参与。2)Ca2+/PKC信号通路参与了心肌细胞缺氧复氧中Egr-1的高表达。
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