研究背景：肝衰竭具有病情危重、预后差、病死率极高、治疗难度大的特点。人工肝支持疗法已被证实是一种能够暂时替代患肝的部分功能,为其肝细胞再生争取时间,使患者得以过渡到自体肝功能恢复或肝移植的有效手段。人工肝支持疗法自上世纪50年代始,从非生物型发展至今,已经进入到生物型、混合型的攻坚阶段。生物型/混合型人工肝得以起效,需要极大量(大于5×109)的具有良好活性和肝细胞功能的细胞。选择适合用于人工肝支持系统的细胞源,是生物型/混合型人工肝的研究热点和难点之一。目前国际上研究较多的细胞源包括：成熟的人肝或猪肝细胞、人肝肿瘤的细胞系(如C3A等)、胎肝细胞、永生化肝细胞株(如本实验室构建的HepLL、HepLi4),以及各种类型的干细胞。虽然细胞材料繁多,但目前尚无一种细胞源能完全满足生物人工肝应用的需要。肝祖细胞是肝脏来源的干细胞,同时具有肝细胞与胆管细胞的表型,自我复制能力强,有向肝细胞和胆管上皮细胞双向分化的潜能,且在发育学上与肝外来源的干细胞相比,具有更接近成熟肝细胞和胆管细胞的优势。因此,这类细胞被认为是一种很有前景的用于肝病治疗的细胞源。但是,肝祖细胞要作为生物人工肝的细胞源应用于临床,还有许多问题亟须解决。其中,进一步明确影响肝祖细胞增殖和分化的因素,建立起安全高效的体外培养和诱导分化体系,是肝祖细胞得以更深入研究和广泛应用的前提和基础。第一部分胶原蛋白应用于肝祖细胞的无血清培养的研究目的：本研究旨在应用胶原蛋白披覆的平板和无血清培养基相结合的方法优化肝祖细胞的无血清培养,以建立更安全的肝祖细胞体外培养体系。方法：以源自TAT启动子-lacZ转基因小鼠的具有双向分化潜能的肝祖细胞系BMEL-TAT为肝祖细胞模型,以不同种类胶原蛋白披覆的常规细胞培养平板和一种无血清培养基相结合的方式,连续培养肝祖细胞14天。选用的胶原蛋白包括Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅰ型和Ⅲ型的混合(质量比1：1),以及Ⅳ型胶原蛋白。以无胶原披覆的细胞培养板结合同种无血清培养基,或结合添加了5%胎牛血清的同种培养基组,分别作为实验的阴性对照和阳性对照。动态观测BMEL-TAT细胞在不同条件下的形态(倒置相差显微镜)、贴壁、增殖(血细胞计数板法、Cellscreen法)和向肝细胞方向自分化(X-gal染色、MUG检测)的程度。结果：BMEL-TAT细胞在所测试的胶原蛋白披覆的培养板上无血清培养时,均呈单层贴壁生长,与含血清培养组的生长模式相似,但其在无胶原的培养板上无血清培养时,呈聚集生长模式。在所测试的胶原蛋白披覆的培养板上无血清培养时BMEL-TAT的贴壁速率、效率和增殖速率均高于普通培养板无血清组,其增殖速率与含血清培养组无显著性统计学差异。X-gal染色和MUG检测的结果基本一致,均提示在各种胶原蛋白披覆的培养板上无血清培养的BMEL-TAT显示出与含血清培养组相当的向肝细胞方向的自分化水平,但其自分化水平低于在普通培养板上无血清培养的BMEL-TAT自分化水平。胶原蛋白Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅰ型和Ⅲ型的混合,以及Ⅳ型能等效地促进BMEL-TAT细胞的贴壁和增殖,对其生长模式和向肝细胞自分化的影响亦相当。结论：选用胶原蛋白Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅰ型和Ⅲ型的混合(质量比1：1),以及Ⅳ型中的任何一种披覆细胞培养板,均能使BMEL-TAT细胞在无血清培养基中实现与常规含5%胎牛血清培养等效的生长、增殖和向肝细胞自分化的水平。第二部分海藻酸-壳聚糖微囊包裹法应用于肝祖细胞向肝细胞方向诱导分化的研究目的：本研究旨在评价海藻酸-壳聚糖微囊包裹技术应用于肝祖细胞向肝细胞方向诱导分化的可行性和有效性,以建立高效的便于放大规模的诱导分化体系,为肝祖细胞进一步应用于微囊相关的生物反应器为核心的生物人工肝提供基础数据。方法：以源自TAT启动子-lacZ转基因小鼠的具有双向分化潜能的肝祖细胞系BMEL-TAT为细胞模型,以海藻酸-壳聚糖微囊包裹5×106/ml和2×106/ml两种BMEL-TAT细胞密度。微囊包裹后在生长培养基中连续培养21天,动态观测微囊内细胞的形态(倒置光学显微镜和激光共聚焦显微镜)、活力(FDA/PI双染色)和增殖(血细胞计数板计数),以及微囊的机械强度。或是微囊包裹后先用生长培养基培养3天后,再换诱导分化培养基连续诱导15天,动态观测细胞的形态(倒置光学显微镜和激光共聚焦显微镜)、活力(FDA/PI双染色)和向肝细胞方向分化的程度(荧光定量PCR检测ALB、TAT、CK19和GGT IV基因的表达,尿素合成功能检测)。诱导分化实验以单层贴壁的BMEL-TAT作为对照。结果：两微囊组在生长培养基中连续培养21天的过程中,包裹BMEL-TAT的海藻酸-壳聚糖微囊具有良好的机械性能,微囊内BMEL-TAT细胞渐呈聚集生长趋势,细胞聚集体形成的时间、数目和大小与包裹的细胞密度密切相关。微囊内细胞具有良好活力,但增殖不明显。两微囊组在生长培养基中培养3天后,换诱导分化培养基连续诱导15天的过程中,海藻酸-壳聚糖微囊内BMEL-TAT细胞呈聚集生长趋势,具有良好活力。荧光定量PCR结果显示海藻酸-壳聚糖微囊包裹的细胞密度高(5×106/ml)时,BMEL-TAT显示出更好的向肝细胞的分化。细胞包裹密度5×106/ml的海藻酸壳聚糖微囊组与单层贴壁组相比,BMEL-TAT细胞中成熟肝细胞相关基因(ALB、TAT)的上调,以及肝祖细胞和胆管上皮细胞相关基因(CK19)的下调均更显著(P<0.05)。两微囊组BMEL-TAT细胞的尿素合成量均在诱导前5天缓慢上升,而后迅速上升至诱导第10天出现高峰,随后有所回落。5×106/ml细胞密度微囊组BMEL-TAT的尿素合成量高于2×106/ml细胞密度微囊组,而2×106/ml细胞密度微囊组又高于单层贴壁组,其中5×106/ml密度微囊组的尿素合成高峰值是单层贴壁组高峰值的2.44倍,且差异具有统计学意义(P<0.05)。荧光定量PCR和尿素合成检测的结果均提示细胞包裹密度5×106/ml的海藻酸-壳聚糖微囊能显著促进BMEL-TAT向肝细胞方向的分化。结论：海藻酸-壳聚糖微囊包裹能促进BMEL-TAT细胞向肝细胞方向的诱导分化,微囊包裹的细胞密度以5×106/ml为宜。