为探讨马度米星铵对心肌和骨骼肌细胞的毒性作用机制,本研究采用H9c2和C2C12细胞作为模型,考察马度米星铵的毒性,检测其对细胞周期分布、细胞凋亡和细胞自噬的影响,探讨细胞内相关信号通路在马度米星铵所致细胞毒性中的作用。具体分为以下几个部分:1.马度米星铵在心肌细胞和骨骼肌细胞中的毒性作用分别以H9c2细胞和C2C12细胞作为心肌细胞和骨骼肌细胞模型,不同浓度马度米星铵（H9c2细胞:0～5μg/mL,C2C12细胞:0～1μg/mL）处理5天,显微镜下观察细胞形态的变化并拍照,胰酶消化后计数;不同浓度马度米星铵（H9c2细胞:0～5μg/mL,C2C12细胞:0～1μg/mL）处理24、48或72h,One solution法检测细胞活性,台盼蓝染色法检测细胞存活率。结果显示,马度米星铵处理5天后,细胞生长被抑制,形态变圆,部分细胞脱落漂浮于培养液中,贴壁细胞中出现空泡,处理组细胞数量明显少于未处理组,呈浓度依赖性;马度米星铵处理24、48或72 h后,细胞活性显著降低,细胞存活率显著下降,呈浓度和时间依赖性。结果表明,马度米星铵抑制H9c2细胞和C2C12细胞生长,降低细胞活性,增加细胞死亡率,马度米星铵对心肌细胞和骨骼肌细胞具有毒性作用。2.马度米星铵对心肌细胞和骨骼肌细胞细胞周期分布的影响及其机制不同浓度马度米星铵（H9c2细胞:0～5μg/mL,C2C12细胞:0～1μg/mL）处理24h或0.5μg/mL马度米星铵处理不同时间（H9c2细胞:0、36、48和72h,C2C12细胞:0、24、48和72 h）,PI染色后经流式细胞仪检测细胞周期的分布;不同浓度马度米星铵（H9c2细胞:0～5μg/mL,C2C12细胞:0～1μg/mL）处理24 h,Western blot检测周期相关蛋白的表达水平。结果显示,不同浓度马度米星铵处理24 h后,H9c2细胞G₀/G₁期比例先升高后降低,S期比例先降低后升高,G₂/M期比例逐渐降低;C2C12细胞G₀/G₁期比例逐渐升高,S期比例逐渐降低,G₂/M期比例逐渐降低;0.5μg/mL马度米星铵处理不同时间后,H9c2细胞和C2C12细胞G₀/G₁期比例逐渐升高,S期比例逐渐降低,G₂/M期比例逐渐降低;不同浓度马度米星铵处理24 h后,H9c2细胞周期素、CDK6、CDC25B表达增加;C2C12细胞Cyclin D1、CDK4、CDK6和CDC25A表达量减少,p21Cip1和p27Kip1表达增加,Rb条带出现位移、磷酸化水平降低。结果表明,马度米星铵对H9c2细胞和C2C12细胞有明显的细胞周期阻滞作用,抑制细胞增殖。3.马度米星铵对心肌细胞和骨骼肌细胞细胞凋亡的影响及其机制不同浓度马度米星铵（H9c2细胞:0～5μg/mL,C2C12细胞:0～1μg/mL）处理72h,Annexin V-PI双染经流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化;不同浓度马度米星铵（H9c2细胞:0～5μg/mL,C2C12细胞:0～1μg/mL）处理24h,Western blot检测凋亡相关蛋白的表达量;z-VAD-fmk预处理1h后马度米星铵（0.5μg/mL和1μg/mL）处理24或48 h,Western blot检测Cleaved caspase 3和Cleaved PARP的表达情况,台盼蓝染色检测细胞死亡率的变化情况;不同浓度马度米星铵（H9c2细胞:0～5μg/mL,C2C12细胞:0～1μg/mL）处理24h,Western blot检测AIF蛋白的表达量,免疫荧光法定位细胞内AIF蛋白。结果显示,马度米星铵处理72 h后,细胞凋亡率显著升高,呈浓度依赖性;马度米星铵处理24h后,H9c2细胞中TRAIL、DR4、Cleaved caspase 8、Cleaved caspase 3和Cleaved PARP的表达水平升高,C2C12细胞中BAK、BAD、TRAIL、DR4、TRADD、Cleaved caspase 9、Cleaved caspase 8、Cleaved caspase 3和Cleaved PARP蛋白表达水平升高;z-VAD-fmk预处理可削弱马度米星铵导致的Caspase 3和PARP蛋白裂解及细胞死亡;马度米星铵处理24 h后,H9c2细胞中AIF表达增加且更多地转位到细胞核中,C2C12细胞中AIF表达量不变但转位到细胞核中的AIF增多。结果表明,马度米星铵能诱导H9c2细胞和C2C12细胞凋亡,从而导致其对心肌细胞和骨骼肌细胞的毒性作用。4.马度米星按对心肌细胞和骨骼肌细胞细胞自噬的影响不同浓度马度米星铵（H9c2细胞:0～5μg/mL,C2C12细胞:0～1μg/mL）处理24 h,Western blot检测自噬相关蛋白的表达量;腺病毒干扰24 h表达GFP标记的LC3蛋白,不同浓度马度米星按（H9c2细胞:0～5μg/mL,C2C12细胞:0～1μg/mL）处理24 h,荧光显微镜下观察定位细胞内LC3蛋白。结果显示,马度米星铵处理24 h后,细胞中LC3Ⅱ和p62蛋白水平升高;腺病毒干扰表达GFP标记的LC3蛋白,马度米星铵处理24h后,荧光显微镜下观察,药物处理组与对照组相比,细胞内有大量绿色荧光点,表明LC3蛋白聚集。结果表明,马度米星铵能诱导H9c2细胞和C2C12细胞自噬并阻断自噬流。5.马度米星铵对心肌细胞和骨骼肌细胞MAPK通路蛋白和蛋白磷酸酶的影响不同浓度马度米星按（0～1μg/mL）处理H9c2细胞和C2C12细胞24 h,Western blot检测MAPK通路相关蛋白和蛋白磷酸酶的表达量;腺病毒干扰表达MKK1-R4F和显性失活PP2A,0.5μg/mL和1μg/mL马度米星铵处理H9c2细胞24 h或48 h,Western blot检测p-ERK蛋白的表达量,显微镜下观察细胞形态的变化并拍照,One solution法检测细胞活性;PP2A抑制剂Okadaic acid预处理1 h,0.5μg/mL和1μg/mL马度米星铵处理H9c2细胞48 h,显微镜下观察细胞形态的变化并拍照,One solution法检测细胞活性;腺病毒干扰表达显性失活c-Jun,0.5μg/mL和1μg/mL马度米星铵处理C2C12细胞24h或48h,Western blot检测c-Jun蛋白的表达量,显微镜下观察细胞形态的变化并拍照,One solution法检测细胞活性;腺病毒干扰过表达PP5,0.5μg/mL和1μg/mL马度米星铵处理C2C12细胞24 h或48 h,Western blot检测p-JNK和p-c-Jun蛋白的表达量,显微镜下观察细胞形态的变化并拍照,One solution法检测细胞活性;JNK抑制剂SP600125预处理1 h,0.5μg/mL和1μg/mL马度米星铵处理C2C12细胞48 h,显微镜下观察细胞形态的变化并拍照,One solution法检测细胞活性。结果显示,马度米星铵处理24 h后,H9c2细胞中p-ERK、p-PP2A和demethylated PP2A（De-PP2A）蛋白水平降低,methylated PP2A（Me-PP2A）表达量升高;C2C12细胞中p-JNK和p-c-Jun蛋白水平升高,PP5蛋白水平降低。H9c2细胞中腺病毒干扰表达MKK1-R4F和显性失活PP2A可削弱马度米星铵对ERK蛋白磷酸化的抑制及细胞毒性;Okadaic acid预处理可削弱马度米星铵细胞毒性。C2C12细胞中腺病毒干扰表达显性失活c-Jun可削弱马度米星铵细胞毒性;过表达PP5可削弱马度米星铵对JNK和c-Jun蛋白磷酸化的激活及细胞毒性;SP600125预处理可削弱马度米星铵细胞毒性。结果表明,马度米星铵增强H9c2细胞PP2A活性,引起ERK蛋白磷酸化水平降低,导致其对心肌细胞的毒性作用;马度米星铵抑制C2C12细胞PP5蛋白表达,使JNK和c-Jun磷酸化水平升高,导致其对骨骼肌细胞的毒性作用。6.马度米星铵对心肌细胞和骨骼肌细胞Akt1-FoxO3a通路的影响不同浓度马度米星铵处理H9c2细胞和C2C12细胞24 h,Western blot检测Akt1、p-Akt1（S473）、p-Akt1（T308）、FoxO3a和p-FoxO3a（Thr132）蛋白的表达量,免疫荧光定位细胞内FoxO3a蛋白;腺病毒干扰表达持续激活Akt,0.5μg/mL和1μg/mL马度米星铵处理细胞24h或48h,Western blot检测p-FoxO3a（Thr132）蛋白的表达量,免疫荧光定位细胞内FoxO3a蛋白,显微镜下观察细胞形态的变化并拍照,One solution法检测细胞活性。结果显示,马度米星铵处理24h后,细胞中p-Akt1（S473）、p-Akt1（T308）和p-FoxO3a（Thr132）蛋白水平降低,细胞核中FoxO3a含量增加。腺病毒干扰表达持续激活Akt可削弱马度米星铵对FoxO3a蛋白磷酸化和胞浆转移的抑制及细胞毒性。结果表明,马度米星铵抑制H9c2细胞和C2C12细胞中Akt1活性,导致FoxO3a蛋白磷酸化水平降低,抑制其胞浆转移,从而导致其对心肌细胞和骨骼肌细胞的毒性作用。7.马度米星铵对心肌细胞和骨骼肌细胞AMPK蛋白的影响不同浓度马度米星铵（H9c2细胞:0～5μg/mL,C2C12细胞：0～1μg/mL）处理24 h,Western blot检测AMPK和p-AMPK（Thr172）蛋白的表达量;腺病毒干扰表达显性失活AMPK,0.5μg/mL和1μg/mL马度米星铵处理细胞24 h或48 h,Western blot检测AMPK蛋白的表达量,显微镜下观察细胞形态的变化并拍照,One solution法检测细胞活性;AMPK抑制剂Compound C预处理1 h,0.5μg/mL和1μg/mL马度米星铵处理细胞48 h,显微镜下观察细胞形态的变化并拍照,One solution法检测细胞活性。结果显示,马度米星铵处理24h后,细胞中p-AMPK（Thr172）蛋白水平升高;腺病毒干扰表达显性失活AMPK和Compound C预处理可削弱马度米星铵细胞毒性。结果表明,马度米星铵增加细胞AMPK蛋白磷酸化水平,从而导致其对心肌细胞和骨骼肌细胞的毒性作用。8.马度米星铵致心肌细胞和骨骼肌细胞氧化应激和内质网应激不同浓度马度米星铵（H9c2细胞:0～5μg/mL,C2C12细胞:0～1μg/mL）处理24或48 h,利用CM-H2DCFDA检测细胞内活性氧水平,Western blot检测PERK、p-PERK（Thr980）、eIF2α、p-eIF2α（Ser51）蛋白表达水平。结果显示,马度米星铵处理24或48 h后,细胞内活性氧水平升高;马度米星铵处理24 h后,细胞内PERK和eIF2α蛋白磷酸化水平升高,呈浓度依赖性。结果表明,马度米星铵能引起H9c2细胞和C2C12细胞氧化应激和内质网应激。