马业由古老的产业向现代马术和赛马产业发展,已经成为当今重要的经济支柱,我国是养马大国,以蒙古马居多。蒙古马具有抗寒、抗病、耐粗饲的特点,在马的遗传资源中是一个及其珍贵的基因库。但是蒙古马的育种繁殖方面研究相对薄弱,从而影响了马匹改良进程。精原干细胞是雄性动物体内唯一能够进行有丝分裂,并且能把遗传信息传递给下一代的干细胞,然而在众多睾丸细胞中精原干细胞数量较少,为其后续分离纯化带来难度。迄今为止,模型动物精原干细胞的纯化培养体系日渐成熟,然而对于马属动物的精原干细胞的体外分离培养却仍然处于初级阶段。因此,本研究通过建立蒙古马睾丸精原干细胞体外分离培养体系,有利于对精原干细胞的长期培养和生长条件的进一步探索,不仅可以揭示蒙古马睾丸精原干细胞的体外增殖特点,还可以进一步探究蒙古马睾丸发育和精子产生机制,对蒙古马的改良以及育种有着重要意义。本实验以2岁蒙古马为研究对象,取其睾丸通过机械分离法和酶逐步消化法获得睾丸单细胞悬液,经过差速贴壁法进行分离纯化精原干细胞,然后接种于事先复苏好的支持细胞饲养层上,并采用碱性磷酸酶(AKP)染色、免疫荧光染色、qRT-PCR进行特异性标志基因鉴定。研究结果如下:1.支持细胞饲养层的制备,采用机械分离法和胶原酶、胰酶逐步消化法联合使用提取睾丸单细胞悬液,使用明胶包被的培养皿进行差速贴壁以期纯化支持细胞,其生长活性旺盛。2.对纯化的支持细胞进行HE染色,发现其形状不规则或者呈辐射状,细胞核染色为蓝紫色,胞质染色为红色,细胞之间紧密相连,符合支持细胞生长特征。3.连续8天检测支持细胞生长活率,发现其生长曲线呈“S”型,根据生长曲线选择前三代生存活力旺盛的细胞进行丝裂霉素C灭活留作饲养层有较高的使用价值。4.采用qRT-PCR方法检测培养5 d的蒙古马睾丸支持细胞特异性表达基因并选用蒙古马成纤维细胞(EFF)为对照,根据计算结果,P值小于0.01,表明支持细胞特异性基因GATA4和GDNF在支持细胞与成纤维细胞中的差异极显著。证明本次关于蒙古马睾丸支持细胞的体外分离与培养实验成功。5.蒙古马睾丸精原干细胞的制备,将睾丸样品进行分离消化,采用明胶、大鼠尾胶原、层粘连蛋白不同基质包被的培养皿差速贴壁法进行纯化,分离纯度为82%。6.使用经过丝裂霉素C灭活的支持细胞作为饲养层相对使用层粘连蛋白作为饲养层,精原干细胞增殖较快,一周以内出现细胞克隆团,细胞活力稳定。7.将精原干细胞进行(AKP)染色,细胞被染成棕褐色,即AKP 阳性,细胞具有干性,属于蒙古马精原干细胞。qRT-PCR检测精原干细胞特异性标志基因TSPYL2、Gfra1、Pgp9.5、CD9、MHC-I,以蒙古马成纤维细胞作为对照,结果为差异极显著(P<0.01),即所培养的为蒙古马精原干细胞,经过免疫荧光染色,检测到干细胞标记物Pgp9.5表达,再次确定所培养的细胞为蒙古马睾丸精原干细胞。