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木豆(Cajanus cajan(Linn.)Millsp)是一种药食同源的豆科植物,具有很高的药用价值。木豆中提取的黄酮类化合物,具有抗氧化、抗菌、抗炎等活性,染料木素和芹菜素是其中两种主要的黄酮类化合物。茉莉酸甲酯与水杨酸是两种常用的非生物诱导子,被广泛应用于药用植物细胞培养来提高次生代谢产物产量。因此本研究在建立木豆不定根培养的基础上,采用茉莉酸甲酯和水杨酸处理木豆的不定根,研究诱导子对木豆不定根总黄酮、染料木素和芹菜素的合成影响及作用机制,并对不定根提取物的生物活性进行了研究。主要研究结果如下:
1.茉莉酸甲酯和水杨酸对木豆不定根总黄酮的合成有明显地促进作用,且这种促进作用受其浓度和作用时间的影响。100μmol/L的茉莉酸甲酯处理木豆不定根48h时,不定根中总黄酮含量和染料木素的含量最高,总黄酮的含量为75.33mg/mL,为对照组的1.87倍,染料木素含量为1385.91μg/g,是对照组的2.93倍。100μmol/L的茉莉酸甲酯处理木豆不定根96h,不定根中的芹菜素含量为103.15μg/g,是对照组的4.27倍。50μmol/L的水杨酸处理木豆不定根48h时,不定根中总黄酮含量、染料木素和芹菜素的含量均达到最大值,不定根中的总黄酮含量为67.58mg/g,为对照组的1.68倍,染料木素含量为542.07μg/g,是对照组的1.74倍,芹菜素含量为83.96μg/g,是对照组的2.48倍。
2.诱导子诱导过程中对木豆不定根抗氧化系统的研究结果表明,O2-,H2O2和MDA含量总体升高,并且显著大于对照组,虽然SOD,POD及CAT的活性增强,但仍不能消除活性氧的影响,诱导子诱导过程中发生了明显的氧化胁迫,这种胁迫导致了木豆不定根次生代谢产物合成能力的提高。
3.研究了质膜Ca2+内流对诱导子诱导过程的影响。加入Ca2+拮抗剂对木豆不定根生物量有一定促进作用,而次生代谢产物的合成不会被Ca2+拮抗剂阻断,并且诱导效果不依赖于外源Ca2+的存在和Ca2+的浓度。
4.诱导子诱导的木豆不定根提取物生物活性研究结果表明,经茉莉酸甲酯与水杨酸处理的不定根的提取物具有较好的生物活性。木豆不定根提取物DPPH自由基的IC50分别为0.378mg/mL与0.723mg/mL,具有较好的DPPH清除能力。木豆不定根提取物对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌、鲍曼不动杆菌)表现出广谱的抑菌作用。茉莉酸甲酯和水杨酸处理的木豆不定根提取物对小鼠黑色素瘤细胞增殖均表现出抑制作用,并且显著大于对照组。其IC50分别为51.22μg/mL和199.32μg/mL。同时这两种木豆不定根提取物对诱导细胞凋亡有一定作用,用500μg/mL木豆不定根提取物处理小鼠黑色素瘤细胞,细胞凋亡率分别为33.06%与22.57%。
综上所述,诱导子茉莉酸甲酯与水杨酸均能促进木豆不定根中黄酮类化合物合成,这种次生代谢产物合成能力的提高可能是由于诱导子诱导过程中发生了氧化胁迫。诱导子诱导的木豆不定根提取物具有较好的生物活性。本研究将为木豆不定根大规模培养体系提供基础数据和理论依据,具有很好的应用前景。
1.茉莉酸甲酯和水杨酸对木豆不定根总黄酮的合成有明显地促进作用,且这种促进作用受其浓度和作用时间的影响。100μmol/L的茉莉酸甲酯处理木豆不定根48h时,不定根中总黄酮含量和染料木素的含量最高,总黄酮的含量为75.33mg/mL,为对照组的1.87倍,染料木素含量为1385.91μg/g,是对照组的2.93倍。100μmol/L的茉莉酸甲酯处理木豆不定根96h,不定根中的芹菜素含量为103.15μg/g,是对照组的4.27倍。50μmol/L的水杨酸处理木豆不定根48h时,不定根中总黄酮含量、染料木素和芹菜素的含量均达到最大值,不定根中的总黄酮含量为67.58mg/g,为对照组的1.68倍,染料木素含量为542.07μg/g,是对照组的1.74倍,芹菜素含量为83.96μg/g,是对照组的2.48倍。
2.诱导子诱导过程中对木豆不定根抗氧化系统的研究结果表明,O2-,H2O2和MDA含量总体升高,并且显著大于对照组,虽然SOD,POD及CAT的活性增强,但仍不能消除活性氧的影响,诱导子诱导过程中发生了明显的氧化胁迫,这种胁迫导致了木豆不定根次生代谢产物合成能力的提高。
3.研究了质膜Ca2+内流对诱导子诱导过程的影响。加入Ca2+拮抗剂对木豆不定根生物量有一定促进作用,而次生代谢产物的合成不会被Ca2+拮抗剂阻断,并且诱导效果不依赖于外源Ca2+的存在和Ca2+的浓度。
4.诱导子诱导的木豆不定根提取物生物活性研究结果表明,经茉莉酸甲酯与水杨酸处理的不定根的提取物具有较好的生物活性。木豆不定根提取物DPPH自由基的IC50分别为0.378mg/mL与0.723mg/mL,具有较好的DPPH清除能力。木豆不定根提取物对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌、鲍曼不动杆菌)表现出广谱的抑菌作用。茉莉酸甲酯和水杨酸处理的木豆不定根提取物对小鼠黑色素瘤细胞增殖均表现出抑制作用,并且显著大于对照组。其IC50分别为51.22μg/mL和199.32μg/mL。同时这两种木豆不定根提取物对诱导细胞凋亡有一定作用,用500μg/mL木豆不定根提取物处理小鼠黑色素瘤细胞,细胞凋亡率分别为33.06%与22.57%。
综上所述,诱导子茉莉酸甲酯与水杨酸均能促进木豆不定根中黄酮类化合物合成,这种次生代谢产物合成能力的提高可能是由于诱导子诱导过程中发生了氧化胁迫。诱导子诱导的木豆不定根提取物具有较好的生物活性。本研究将为木豆不定根大规模培养体系提供基础数据和理论依据,具有很好的应用前景。