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目的: 建立哮喘小鼠模型,探讨在哮喘发生发展过程中nuocytes与Th9细胞的作用和相互关系,从区域免疫学的角度分析两类细胞参与哮喘免疫病理的作用。 方法: (1)哮喘小鼠模型的建立:第1和第11天以卵白蛋白(OVA)50μg和10%氢氧化铝佐剂两次腹腔注射致敏小鼠,于致敏后的第22天至第26天雾化吸入2.5%的OVA溶液,每次半小时,第27天即作为哮喘小鼠模型用于各种指标的检测。 (2)主要炎症和过敏指标的检测:无菌剪取小鼠肺组织,经Troziol提取得到RNA,逆转录得到cDNA。小鼠肺组织中炎症因子受体(FcεRIa,IL-5Rα和IL-13Rα等)由荧光定量PCR法检测,外周血IgE浓度由ELISA进行检测。 (3)肺组织内nuocytes和Th9细胞相关细胞因子或转录因子的检测:利用荧光定量PCR法检测RORα、IL-9等蛋白的表达水平。 (4)流式细胞仪检测肺组织和外周血nuocytes与Th9细胞数量:无菌提取肺组织,剪刀剪碎后在37℃水浴箱中经Ⅰ型胶原酶消化,每隔10min轻微吹打混匀一次,2h后过70um筛网,然后溶解红细胞并离心获得沉淀细胞,制成细胞悬液以Lin-ICOS+ST2+为标准圈定nuocytes细胞,以IL-4-IL-9+为标准圈定Th9细胞。 (5)统计学分析:应用SPSS11.5软件包进行统计学分析,所有实验至少重复三次。正太分布资料的数据以(均数±标准差)表示,对于两组之间的统计分析采用非配对t检验, P<0.05有统计学意义。对于多组之间的统计分析采用One-wayANOVA,P<0.05具有统计学意义。 结果: (1)哮喘小鼠建模成功:模型小鼠具有明显的哮喘表现和实验室指证,其主要表现为烦躁不安、频繁瘙痒、呼吸加深加快、大小便失禁等,对照组无异常表现。HE染色光镜观察可见,嗜酸粒细胞浸润、粘膜皱壁减少、杯状细胞增生等病理改变。同时,血清IgE水平显著升高且呈现Th2型细胞因子的大量分泌。 (2)荧光定量PCR技术检测结果表明,小鼠肺组织中MBP-1/2、FcεRIa、IL-5Rα、 IL-13 Rα2等的mRNA表达水平相比于对照组皆显著升高。 (3)荧光定量PCR检测Nuocytes和Th9细胞相关分子发现,小鼠肺组织中RORα、IL-9、IL-9α、PU.1、IRF4 mRNA的表达显著升高。经相关性分析发现,IL-9的mRNA水平与RORα、IL-5Rα和IL-13Rα2 mRNA水平呈明显正相关,且血清总IgE水平与IL-5Rα、IL-9Rα和IL-13Rα2 mRNA水平呈明显的正相关。 (4)免疫荧光和流式细胞仪检测结果显示:肺组织中nuocytes和Th9细胞数量明显高于对照小鼠。 结论: 在哮喘模型小鼠肺组织,呈现nuocytes与Th9细胞优势分化状态,相关性分析表明二者呈现明显正相关,两类细胞的优势分化状态与IgE等免疫病理指标相一致,表明在哮喘的发生发展过程中,Nuocytes与Th9细胞相互作用协同参与哮喘的免疫病理损伤。此外,哮喘小鼠肺组织呈现的IL-5Rα、IL-13Rα和FcεRIa表达上调,意味着肺组织对这两种细胞作出的积极应答。