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小反刍兽疫(peste des petits ruminants,PPR)俗称羊瘟,又被称为小反刍兽假性牛瘟,是一种由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的急性或亚急性传染病。世界动物卫生组织(The World Organization for Animal Health,OIE)将其列为必须通报疫病,我国将其列为一类动物疫病。2007年7月在我国西藏阿里地区出现了中国首例小反刍兽疫,2014年我国大面积爆发小反刍兽疫,波及20余省份,给当地养羊业造成巨大经济损失。此外,小反刍兽疫经空气传播,最易感的是小反刍动物,尤其野生小反刍动物不受国界限制,很容易造成全球性蔓延,所以有效的预防显得尤为重要。弱毒疫苗是OIE规定的唯一允许使用的小反刍兽疫病毒疫苗,然而PPRV对热非常敏感,疫苗在保护和运输过程中保持冷链状态相对较为困难。此外,减毒活疫苗还存在毒力返强的风险,这就限制了PPR弱毒疫苗的大规模田间使用,因此迫切需要开发一种安全有效、热稳定性好的疫苗候选。相比弱毒疫苗与灭活疫苗,病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗成为安全稳定的疫苗候选者之一,病毒样颗粒是由病毒一个或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的空心蛋白颗粒。在形态上,VLPs类似于真实的病毒粒子,但是由于缺乏具有感染性的核酸,故无复制和感染能力。虽然病毒样颗粒不具有感染性,但VLPs具有类似于天然病毒的理化性质,能被抗原提呈细胞摄取加工提呈,激发细胞免疫反应和体液免疫应答,具有安全性高和免疫原性好的优点。流感VLPs疫苗、乙型肝炎VLPs疫苗及猪圆环病毒2型VLPs疫苗都已进入临床试验或者已被比准上市。但目前为止,有关小反刍兽疫病毒病毒样颗粒(PPRV VLPs)构建研究的报道较少。因此,本研究利用杆状病毒昆虫细胞表达系统构建生产不同毒株的PPRV VLPs,并对其免疫原性进行研究比较,选取免疫原性好的毒株的病毒样颗粒进行本动物免疫,为开发安全、有效的小反刍兽疫病毒样颗粒候选疫苗奠定基础。第1章:小反刍兽疫M、F和H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备本研究以PPRV疫苗株Nigeria 75/1株为研究对象,分别针对其M、F和H蛋白的主要抗原表位区设计克隆引物,通过RT-PCR扩增去除跨膜区和信号肽序列而保留主要抗原表位区片段,将编码序列大小分别为1005 bp PPRV M基因片段克隆至原核表达载体p ET-30a(+)中,将编码序列大小分别为1653 bp和1245 bp的PPRV F、H基因片段分别克隆至原核表达载体p GEX-4T-1中,构建重组质粒p ET-30a(+)-M、p GEX-4T-1-F和p GEX-4T-1-H。将各表达质粒转化宿主菌Transetta(DE3),表达条件经优化后最终确定为0.4m M IPTG和37℃条件下诱导表达4h,经SDS-PAGE分析结果显示重组质粒p ET-30a(+)-M、p GEX-4T-1-F和p GEX-4T-1-H在大肠埃希菌中分别诱导表达出分子质量为61 k D、66 k D和60 k D的重组蛋白,大小与预期相符,主要以不溶性包涵体形式存在。Western blot鉴定结果显示M、F、H重组蛋白均能被绵阳抗PPRV多克隆抗体特异性识别。以经Ni-NTA亲和层析纯化后的M、F和H重组蛋白分别免疫昆明鼠,经3次免疫后采血,分离血清,制备鼠抗PPRV M、F和H蛋白多克隆抗体,为后期鉴定重组杆状病毒奠定了基础。第2章:小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,本研究扩增了Nigeria 75/1株M、F和H基因,构建了含有双目的基因的重组杆状病毒rp FB-2M、rp FB-2F和rp FB-2H。以鼠抗M、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体与绵羊抗PPRV阳性血清对重组杆状病毒感染细胞进行间接免疫荧光(IFA)鉴定,可见特异性荧光;以三种重组杆状病毒共感染昆虫细胞Sf9的方式组装病毒样颗粒,放大培养后进行病毒样颗粒纯化。电镜下可以到80-100nm左右的病毒样粒子,且表面纤突明显。Western blot检测纯化后样品可见相对分子质量为38k D,59k D和68k D左右的条带,表明基质膜蛋白与两种囊膜糖蛋白成功组装出病毒样颗粒,且免疫小鼠可诱导产生保护性中和抗体。第3章:China/tibet/geg/07-30株PPRV病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,本研究扩增了PPRV China/tibet/geg/07-30株(Gen Bank Access No.FJ905304.1)M、F、H和N基因,构建了含有双目的基因的重组杆状病毒rp FB-2M、rp FB-2F、rp FB-2H和rp FB-2N。以鼠抗M、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体与绵羊抗PPRV阳性血清对重组杆状病毒感染细胞进行间接免疫荧光(IFA)鉴定,可见特异性荧光;以四种重组杆状病毒共感染昆虫细胞Sf9的方式组装病毒样颗粒,放大培养后进行病毒样颗粒纯化。Western blot检测纯化后样品可见相对分子质量为38k D,59k D,68k D和58k D左右的条带,表明基质膜蛋白、核衣壳蛋白与两种囊膜糖蛋白成功组装出病毒样颗粒,且免疫小鼠和山羊可诱导产生保护性中和抗体。免疫VLPs的小鼠触发显著增多的分泌IFN-γ或IL-4的CD4+T和CD8+T细胞;免疫PPRV弱毒的小鼠触发显著增多的分泌IL-4的CD4+T和CD8+T细胞;VLPs诱导产生强大的特异性Ig G2a抗体反应,倾向于Th1型免疫应答;与之相反,PPRV诱导产生更多的Ig G1抗体反应,倾向于Th2型免疫应答;VLPs促进B细胞和DC募集和/或活化,T淋巴细胞增殖和活化,因此,PPRV VLPs具有开发成为安全有效的新型动物疫苗的潜能。第4章:China/tibet/geg/07-30株PPRV病毒样颗粒在High5细胞中的高效表达及其免疫原性研究以期利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统比较病毒样颗粒在High5细胞和Sf9细胞中的表达量,本研究扩增了PPRV China/tibet/geg/07-30株(Gen Bank Access No.FJ905304.1)M、F和H基因,构建了含有目的基因的重组杆状病毒rp FB-M-F-H。以鼠抗M、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体与绵羊抗PPRV阳性血清对重组杆状病毒感染细胞进行间接免疫荧光(IFA)鉴定,都可见特异性荧光,表明基质膜蛋白与两种囊膜糖蛋白在两种细胞中得到表达;间接免疫荧光试验、Western blot检测及血凝试验试验结果总体表明High5细胞更能高效的包装病毒样颗粒,产量要高于Sf9细胞。以重组杆状病毒感染昆虫High5细胞和Sf9细胞组装病毒样颗粒,放大培养后进行病毒样颗粒纯化。后期将High5细胞生产的病毒样颗粒免疫小鼠和可诱导产生保护性中和抗体和细胞免疫。