鼻咽癌可视化动物模型的建立

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分子影像学可实现在活体生物内细胞、基因和分子水平的生理或病理过程的实时动态无创成像,其中光学成像技术中的荧光技术和生物发光技术发展迅速,已广泛应用于各类肿瘤可视化动物模型中,为研究活体内肿瘤细胞与其周围环境相互作用过程,提供了一种全新的监测方法,为更清晰和深入地了解肿瘤的发生、发展及侵袭转移提供了良好的平台。  鼻咽癌(NPC)是东南亚、特别是我国南方数省常见的恶性肿瘤,作为一种有着鲜明特点的头颈部肿瘤,其呈低分化,恶性程度高,早期即可出现颈部淋巴结转移。建立人鼻咽癌可视化动物模型,能促进对鼻咽癌分子机制及诊断治疗的深入研究。  首先,我们采用脂质体法将荧光蛋白和荧光素酶基因表达质粒(pEGFP-N1、p GL3-Control、Luc-DsRed2)导入人鼻咽癌细胞株中(5-8F、6-10B、CNE1-LMP1、C666-1),利用G418或潮霉素进行压力筛选。经过20多天的筛选,我们挑取单独稳定表达荧光蛋白、单独稳定表达荧光素酶及同时稳定表达荧光蛋白和荧光素酶的亚克隆细胞株。其中具代表性的细胞株有:单独稳定表达绿色荧光蛋白的5-8F-GFP-F细胞株、单独稳定表达荧光素酶的5-8F-Luc-Z、同时表达绿色荧光蛋白和荧光素酶的5-8F-Luc-GFP-M及同时表达红色荧光蛋白和荧光素酶的CNE1-LMP1-Luc-DsRed2-E细胞株。接着,我们分别利用上述4株细胞,通过皮下接种技术及裸鼠鼻咽原位接种技术,分别建立了裸鼠皮下移植瘤和裸鼠鼻咽原位移植瘤可视化动物模型。  结果证实:5-8F-GFP-F细胞株和5-8F-Luc-Z细胞株在裸鼠皮下和鼻咽部均具有较好的成瘤能力,并能稳定表达目的基因绿色荧光蛋白或者荧光素酶。在精诺真IVIS LuminaⅡ成像系统下,两株细胞都分别成功的建立了裸鼠皮下移植瘤及鼻咽原位移植瘤可视化动物模型。5-8F-GFP-F细胞株稳定表达绿色荧光蛋白,皮下移植瘤荧光信号定位清晰,能准确的反映皮下肿瘤体积大小及生长情况;与之相对应的鼻咽原位移植瘤可视化动物模型中,则需将裸鼠口腔打开,才能够采集到荧光信号,从而实现对鼻咽原位肿瘤的实时、动态监测,这可能与裸鼠鼻咽腔周围解剖结构复杂及GFP深层组织穿透能力有限等因素有关。此外,裸鼠毛发等存在自发荧光干扰信号,这些因素,在一定程度上影响了GFP的适用范围。在5-8F-Luc-Z细胞株建立的可视化动物模型中,腹腔注射荧光素酶底物D-Luciferin后,无论是裸鼠皮下移植瘤还是鼻咽原位移植瘤,均能采集到很强的荧光信号,定位准确、清晰、亦可实时、动态监测肿瘤的生长情况。与GFP相比,荧光素酶灵敏度更高、深层组织穿透能力更强、几乎无干扰背景,其建立的鼻咽癌可视化动物模型具有其独特之处。与此同时,为结合GFP和Luc两者的优点,我们通过共转染方式将GFP和Luc两者同时标记5-8F-Luc-GFP-M细胞株,并建立了相应可视化动物模型。结果发现:两种荧光均没有检测到,可能与绿色荧光蛋白和荧光素酶的表达水平均偏低有关,表明通过共转染方式结合两者,并应用于可视化动物模型的建立,有一定困难。此外,我们还将红色荧光蛋白和荧光素酶两者整合到同一个载体Luc-DsRed2上,筛选出稳定细胞株CNE1-LMP1-Luc-DsRed2-E并建立了相应的人鼻咽癌可视化动物模型。结果进一步证实:荧光素酶是很好的肿瘤细胞示踪剂,无论体外还是体内水平荧光素酶均能够准确示踪肿瘤细胞,且细胞数越多,产生的荧光信号越强;红色荧光蛋白可能受基因本身表达水平、组织穿透能力及仪器灵敏度的多种因素影响,体内水平监测受限。  最后,我们在CNE1-LMP1-Luc-DsRed2-E细胞株建立的人鼻咽癌可视化动物模型基础上,将临床鼻咽癌一线治疗药物顺铂应用到该模型中,比较了顺铂治疗前后,鼻咽原位肿瘤荧光信号强度的变化情况,并用TUNEL实验检测肿瘤组织的凋亡情况。研究证实:顺铂能有效抑制鼻咽癌的生长,并能通过诱导肿瘤细胞的凋亡来治疗鼻咽癌。此外,还发现鼻咽癌对局部颅底骨组织有侵袭作用,可能与LMP1相关。  综上,本研究以多株稳定表达荧光蛋白和荧光素酶的人鼻咽癌克隆细胞株为基础,通过建立人鼻咽癌可视化动物模型,为从活体水平、细胞及分子水平上实时、定量、动态的研究鼻咽癌的生物学特性,探讨其分子发病机制、开发新药及新临床治疗方案等提供了一个新的实验平台。  
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