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红曲霉(Monascus spp.)是我国乃至全亚洲传统发酵中的一类菌株。能够产生GABA——γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric Acid)、红曲色素、红曲多糖以及MonacolinK等多种益生物质,但其所产的肾毒素——桔霉素(Citrinin)不能忽视。随着生活水平的提高,Monacolin K的降血脂功效日益被医药行业提上日程。因此从发酵和分子生物学手段获得高产Monacolin K、低产桔霉素的红曲霉菌株意义重大。本实验首先筛选到桔霉素产量低,而Monacolin K相对较高的紫色红曲霉M-24;随后通过对其发酵条件中的6个因素进了优化,并采用该条件进行了发酵罐实验;将发酵罐中的培养液进行分离和纯化,最终获得了相对纯度较高的MonacolinK产品;接下来构建了敲除载体。主要研究成果如下:1、红曲霉菌株筛选与鉴定从红曲米、红曲腐乳等中筛选到278个红曲霉菌株,通过HPLC法对其发酵液Monacolin K进行检测,挑选出10株产量较高的菌株;并采用薄层层析法(TLC)结合桔霉素紫外全波长扫描,最终表明24号菌株为目标菌株。并从形态学特征、显微特性和ITS测序结果进行了鉴定,鉴定为紫色红曲霉M-24(Monascus purpureusM-24)菌株。2、对目的菌株进行发酵优化实验获得目的菌株后,首先采用250 mL摇瓶对其进行以碳源、氮源、碳氮比、pH、培养温度和摇床转速这6个条件的单因素实验。得到最优条件后,以该条件进行5 L发酵罐实验,并绘制了发酵过程中M-24菌株的生长曲线、Monacolin K的产量变化、桔霉素含量变化和色素色价变化的曲线。3、发酵液中Monacolin K的分离纯化接下来对发酵后的培养液进行Monacolin K的分离纯化。分离的方法参照日本远藤章教授的方法;纯化则采用半制备型高效液相法,采用两次两阶段分离法。4、桔霉素相关PKS基因的敲除载体构建在对M-24菌株产Monacolin K的产量了解后,有必要对桔霉素的产量进行控制,这里本实验采用基因敲除的手段,对桔霉素的相关PKS基因进行敲除,并通过双接头PCR法(Double-joint PCR)构建了敲除载体。