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目的：骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤,目前临床治疗以手术治疗为主,辅以放化疗,但治疗效果仍不理想。肿瘤干细胞学说认为肿瘤复发难治的根源在于肿瘤中存在着肿瘤干细胞,目前多数学者认为CD133和CD44为骨肉瘤类肿瘤干细胞表面标志。有研究表明肺腺癌类肿瘤干细胞表面β1,6分支N-糖链表达异常增加,而乳腺癌表面的β1,6分支N-糖链缺失可以诱导巨噬细胞发生M1型表型转换,使其发挥抗肿瘤作用。然而,p1,6分支N-糖在骨肉瘤中的作用却鲜有报道。基于此,本研究拟检测骨肉瘤类肿瘤干细胞表面N糖苷表达情况,并研究其对巨噬细胞表型转换的影响,以期进一步阐明骨肉瘤肿瘤免疫逃逸机制,为骨肉瘤的免疫治疗奠定基础。方法：1.通过无血清培养法培养小鼠骨肉瘤细胞株LM8,初步获得骨肉瘤悬浮细胞球,通过磁珠细胞分选的办法,通过二次阳性分选得到CD133及CD44双阳性的LM8细胞。通过流式细胞术检测分选后细胞表面CD133分子及CD44分子的表达情况。2.使用不同剂量的N糖基化抑制剂苦马豆素处理分选得到的骨肉瘤类肿瘤干细胞,通过凝集素结合实验检测细胞表面β1,6分支N-糖链的表达水平。3.获取小鼠骨髓细胞,加入GM-CSF诱导其中单核细胞向巨噬细胞分化,8日后流式细胞术检测细胞表面巨噬细胞表面特异性分子F4/80的表达水平。4.将不同浓度苦马豆素处理之后的骨肉瘤类肿瘤干细胞与小鼠骨髓来源的巨噬细胞共同培养,荧光实时定量PCR法检测巨噬细胞中iNOS和Arg-1的RNA表达水平,精氨酸酶活性检测试剂盒检测巨噬细胞培养上清中精氨酸酶活性,ELISA法检测巨噬细胞培养上清中TNF-a和IL-10含量。结果：1.流式细胞术检测结果表明,通过无血清培养初步分离后再进行磁珠分选得到的的细胞中CD133和CD44双阳性细胞比例为96.5±1.2%。该结果表明我们成功分离得到骨肉瘤类肿瘤干细胞。2.凝集素结合实验显示,骨肉瘤类肿瘤干细胞与L-PHA具有更高的结合率,达90.3±2.1%,高于LM8细胞的结合率54.3±3.1%,差异具有统计学意义(P<0.05)。用lmg/mL的苦马豆素处理骨肉瘤类肿瘤干细胞后,细胞表面β1,6分支N-糖链的表达阳性率为90%,用5mg/mL的苦马豆素处理骨肉瘤类肿瘤干细胞后,细胞表面β1,6分支N-糖链的表达阳性率为21%,以上结果表明随着苦马豆素剂量的增加,骨肉瘤类肿瘤干细胞表面β1,6分支N-糖链的表达阳性率降低。3.流式细胞术检查结果显示,骨髓来源巨噬细胞经过诱导培养8天后,F4/80阳性细胞率为95.4%,表明骨髓来源巨噬细胞培养成功。4.骨肉瘤类肿瘤干细胞与骨髓巨噬细胞共培养48小时后,与单独巨噬细胞相比,共培养后的巨噬细胞内Arg-1的mRNA表达量上升(40±2.6% v.s.4±2.6%,P<0.05), iNOS mRNA表达量无显著差异(12±1.3% v.s.8±4.6%,P>0.05),共培养上清中IL-10含量上升(150±6.8pg/mL v.s.50±3.8pg/mL, P<0.05), TNF-a含量无显著差异(50±3.3pg/mL v.s.55±4.8pg/mL, P>0.05),该结果表明与骨肉瘤类肿瘤干细胞培养后,巨噬细胞中M2型标记分子Arg-1和IL-10表达上升,M1型标记分子iNOS与TNF-a表达无显著变化,表明骨肉瘤类肿瘤干细胞诱导巨噬细胞向M2型分化。当我们用苦马豆素(1mg/mL)处理后的骨肉瘤类肿瘤干细胞与骨髓巨噬细胞共孵育后,与未处理的骨肉瘤类肿瘤干细胞相比,巨噬细胞中M2型标记分子Arg-1(12±3.1%v.s.40±2.6%, P<0.05)和IL-10(90±4.4 pg/mL v.s.150±6.8 pg/mL,P<0.05)表达下降,M1型标记分子iNOS(50±2.1%v.s.12±1.3%, P<0.05)TNF-a与(240±8.1pg/mL v.s.50±3.3pg/mL, P<0.05)表达上升,且该变化随着苦马豆素浓度的提高而进一步增强。结论：骨肉瘤类肿瘤干细胞表面高表达β1,6分支N-糖链,苦马豆素可以降低其细胞表面β1,6分支N-糖链的表达。骨肉瘤类肿瘤干细胞可以诱导小鼠骨髓来源的巨噬细胞向M2型分化,当用苦马豆素降低骨肉瘤类肿瘤干细胞表面N糖苷的表达后其诱导巨噬细胞向M2型分化的能力减弱。针对β1,6分支N-糖链合成的各类抑制剂,如苦马豆素,有望成为一种新的治疗骨肉瘤的辅助药物。