目的:体内观察肉苁蓉苯乙醇总苷(CPhGs)对牛血清白蛋白(BSA)诱导的免疫性肝纤维化大鼠的影响,分析血清学指标、肝组织病理及免疫组化指标,评价CPhGs抗肝纤维化的作用。体外观察CPhGs对HSC的增殖和凋亡及对细胞活力的影响,从细胞学水平阐述CPhGs抗肝纤维化的作用;同时研究CPhGs对TGF-β1/smad和PDGF/ERK1/2信号传导通路的影响,探讨其抗肝纤维化的作用靶点,从分子水平阐明其作用的分子机制,为其进一步的新药开发提供基础数据。方法:1)实验选用SPF级雄性SD大鼠75只,分为6组,即正常对照组、肝纤维化模型组、复方鳖甲软肝片阳性对照组(BJRG,600 mg/kg)、CPhGs高剂量组(500 mg/kg)、中剂量组(250 mg/kg)、低剂量组(125 mg/kg),CPhGs高中低剂量组每组各13只,其余每组各12只。建立大鼠免疫性肝纤维化模型,造模同时给药干预,除空白对照组和模型组灌胃给予蒸馏水外,其余各组均按设定剂量灌胃给药;造模结束后继续治疗4周,给药结束后收集大鼠血清、肝、脾组织,采用全自动生化仪检测大鼠血清丙氨酸转氨酶(GPT)、天冬氨酸氨基转移酶(GOT)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血清总胆红素(TB)、血清直接胆红素(DB);放射免疫法检测血清中透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)含量;ELISA测定血清TGF-β1水平;HE染色及Masson染色观察肝脏病理组织学变化;免疫组化法测定肝组织中TGF-β1、I型胶原、Ⅲ型胶原蛋白的表达。2)采用HSC分别以含CPhGs浓度为0,3.91,7.81,15.63,31.25,62.50,125.00,250.00,500.00μg/mL浓度的培养液体外培养48 h。用四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测细胞增殖情况,测量CPhGs对HSC的半数抑制率(IC50);选取CPhGs(25,50,100μg/mL)作用于HSC及正常肝细胞(HL7702),24h、48h、72h、96 h后MTT法检测不同受试药物对HSC及HL7702增殖的影响;LDH比色法测定药物细胞毒性;流式细胞仪检测CPhGs(25,50,100μg/mL)对HSC凋亡的影响;进一步RT-PCR法检测CPhGs对HSC细胞α-SMA、Caspase3、NF-kB p65 mRNA表达,Western blot法检测不同受试药物对凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达的影响。3)MTT观察25,50,75,100μg/mL浓度的CPhGs在不同时间对TGF-β1诱导的HSC增殖的影响,采用RT-PCR法检测25,50,75,100μg/mL浓度的CPhGs对smad2、smad3、smad7mrna的表达;采用westernblot法检测25,50,75,100μg/ml浓度的cphgs对tgf-β1/smad通路蛋白smad2,smad3,p-smad2,p-smad3和smad7的表达。mtt法观察25,50,75,100μg/ml浓度的cphgs在不同时间对血小板衍生生长因子(pdgf)诱导的hsc增殖的影响,采用rt-pcr法检测25,50,75,100μg/ml浓度的cphgs对α-sma、i型胶原、erk1/2、c-fos、c-junmrna的表达;采用westernblot法检测25,50,75,100μg/ml浓度的cphgs对pdgf/erk1/2通路蛋白i型胶原、erk1/2、p-erk1/2表达的差异。结果:1)与模型组相比,cphgs各剂量组肝纤维化大鼠的肝脾指数均明显降低(p<0.05),血清肝功能酶中除低剂量组tb和db外,cphgs其余剂量组的gpt、got、alp、tp、tb和db含量明显下降(p<0.05),alb含量明显升高(p<0.05)血清肝纤维化标志ha、ln、pciii、iv-c含量均显著降低(p<0.05或p<0.01),肝组织hyp含量降低(p<0.01),血清tgf-β1含量降低(p<0.01),并且,cphgs高剂量组的肝脾指数、血清学指标、肝纤维化四项指标、hyp含量的效果与bjrg阳性对照组接近;he染色、masson染色结果显示cphgs各剂量组肝纤维化程度减轻,肝小叶结构基本完整,胶原纤维沉积明显减少,假小叶形成减少,均显著低于模型组(p<0.01),cphgs高、中剂量组肝纤维化程度与bjrg阳性对照组相当,各剂量组肝组织中i型胶原、Ⅲ型胶原蛋白表达明显受到抑制(p<0.05或p<0.01),i型、Ⅲ型胶原较模型组比较,仅见于中央静脉周围及汇管区,病理着色浅且少,呈现细丝状纤维;tgf-β1的表达显示,细胞浆的棕黄色表达面积较模型组明显缩小,染色以浅黄色为主(p<0.01)。2)cphgs对hsc的增殖抑制率随着药物浓度的升高逐渐升高,ic50为119.125μg/ml;不同浓度的cphgs对hl7702有轻度的增殖作用,差异无统计学意义;(25-100)μg/ml的cphgs对hsc细胞没有明显的毒性作用(p>0.05);流式细胞仪检测结果显示,cphgs100μg/ml浓度组的凋亡率最高,为20.8%,与空白对照组比较,差异具有统计学意义(p<0.01);rt-pcr结果显示,与空白对照组比较,不同浓度的cphgs均可抑制α-sma、nf-kbp65mrna水平,促进caspase3mrna水平,westernblot分析结果显示,与空白对照组比较,不同浓度的cphgs药物组hscbcl-2/bax均明显降低(p<0.05)。3)(50-100)μg/ml的cphgs可以抑制tgf-β1诱导的hsc的增殖(p<0.05);(25-100)μg/ml剂量组的cphgs均可抑制smad2和smad3mrna和蛋白水平的表达,并且明显抑制smad2和smad3蛋白的磷酸化水平,促进smad7mrna和蛋白的表达。4)(50-100)μg/ml的cphgs可以抑制rrpdgf-bb诱导的hsc的增殖(p<0.05);(25-100)μg/ml剂量组的cphgs均可抑制α-sma、i型胶原、erk1/2、c-fos、c-junmrna水平,westernblot法检测cphgs可明显抑制i型胶原、erk1/2、p-erk1/2蛋白表达水平。结论:1)cphgs对bsa诱导的大鼠免疫性肝纤维化具有较好的保护作用,其机制可能与降低tgf-β1、i型、Ⅲ型胶原蛋白表达进而抑制肝星状细胞活化、减少胶原生成有关。2)CPhGs可明显抑制HSC细胞增殖,诱导其凋亡;对HL7702的生长具有正向调节作用;其诱导HSC凋亡的机制可能与降低Bcl-2蛋白表达,增加bax蛋白表达及降低Bcl-2/Bax比值有关。3)CPhGs的抗肝纤维化作用可能与其阻断TGF-β1/smad通路及PDGF/ERK1/2通路进而阻断HSC的活化、增殖有关。