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衰老指机体发育成熟后,生理功能逐渐下降,组织和器官发生退行性改变,并最终走向死亡的不可避免的过程。随着医学的发展,延缓衰老成为研究的热点,衰老与下丘脑-垂体-性腺轴功能衰退密切相关,其中性腺具有重要的调节作用。衰老的基本特征是细胞衰老。细胞衰老过程是借助于信号转导途径实现的,许多细胞因子亦参与到这些信号途径中。当这些途径所涉及的关键调节因子发生改变,细胞将延缓衰老或绕过衰老程序继续增殖。近年来衰老相关基因及其调控变化,已成衰老机理研究的主要倾向。其中p16/Rb和p19/p53/p21信号转导通路至关重要。传统医学认为肾虚是衰老的根本内因,肾中精气的盛衰决定着衰老的速度。补肾方剂何首乌饮(又名天年饮)具有补肝肾、益精血、延年益寿之功效。本研究采用D-半乳糖致亚急性衰老雄性大鼠模型,用现代生物学技术,从生化-组织-蛋白-基因水平等不同层次探讨何首乌饮对衰老雄性大鼠睾丸生殖功能的影响及其抗衰老的机制,为延缓衰老提供实验依据,为研究和开发临床抗衰老中药积累资料。第一部分何首乌饮对衰老雄性大鼠睾丸生精功能的影响目的:观察何首乌饮对D-半乳糖所致亚急性衰老模型大鼠精子数量、活动度和存活率的影响,血清LH、FSH、睾酮及下丘脑GnRH的浓度,睾丸组织HE染色和IGF-1 mRNA表达水平。方法:1衰老模型建立及分组:选用8周龄清洁级雄性SD大鼠(Sprague–Dawley rats,SD)105只,体重180～220g,由河北医科大学实验动物中心提供。随机选取15只作为正常对照组(腹腔注射等量的生理盐水),其余大鼠均采用生理盐水配制的6% D-半乳糖溶液(300mg·kg-1·d-1)连续腹腔注射60 d。然后所有大鼠进行Morris水迷宫行为学实验;并于造模的第60 d所有大鼠经内眦眶后静脉取血约1.5 mL,离心取上清,检测血清超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量,判断造模是否成功。判断标准:Morris水迷宫定位航行试验潜伏期明显延长:正常组(8.91±7.59)s,模型组(30.05±3.39)s,空间探索试验穿越平台的次数明显减少:正常组(7.11±2.36)次/min,模型组(2.36±1.08)次/min。血清SOD含量显著下降、MDA显著升高者定为造模成功。将造模成功的大鼠分为模型组、何首乌饮低、中、高剂量组、阳性对照组,阴性对照组(自然恢复组),每组均为15只。模型组不再作任何处理,何首乌饮低、中、高剂量组分别给予何首乌饮(9.6、19.2、38.4 g/kg/d)灌胃,阳性对照组给予何首乌丸(8.24 g/kg/d)灌胃,阴性对照组灌胃等量的生理盐水,60 d。2方法(1)判断衰老模型是否建立成功:造模60 d后,所有大鼠进行Morris水迷宫行为测试:定位航行试验(Place navigation test, PNT)和空间探索试验(Spatial probe test, SPT)。大鼠用10%水合氯醛麻醉,经内眦眶后静脉取血约1.5 mL,离心取上清。分别采用黄嘌呤酶法和TAB法检测血清SOD的活力和MDA含量。(2)室温下,大鼠用10%水合氯醛麻醉,取大鼠一侧附睾头(每只取材的重量保持一致),放入盛有5 mL生理盐水并在37℃水浴中预热的小培养皿中,剪碎成精子悬液。观察精子计数、活动度和存活率。(3)大鼠用10%水合氯醛麻醉,经内眦眶后静脉取血约1.5 mL,离心取上清。用放射免疫法检测血清LH、FSH、睾酮浓度。采用组织匀浆法和放射免疫法检测下丘脑GnRH浓度。(4)大鼠经含4%多聚甲醛灌注固定,取睾丸,常规石蜡包埋,HE染色法检测各组大鼠睾丸组织的变化情况。(5)大鼠经含1‰二乙基焦磷酰胺(diethyl pyrocarbonate, DEPC)的4%多聚甲醛灌注固定,取双侧睾丸,常规石蜡包埋,原位杂交法检测各组大鼠睾丸细胞IGF-1 mRNA的变化情况。结果:1 PNT表明,前2 d各组的潜伏期成绩无显著性差异(P>0.05),随学习时间的延长各组潜伏期均逐渐缩短,模型大鼠的潜伏期成绩与正常大鼠比较明显延长(P<0.05)。SPT表明,模型大鼠穿越平台的次数(2.36±1.08)次/min,明显低于正常大鼠(7.11±2.36)次/min。2衰老大鼠模型组血清SOD活力明显下降,MDA含量明显上升,与正常对照组比较差异显著(P<0.01)。3何首乌饮对衰老大鼠精子的影响:模型组精子的活动度、存活率和精子的数量均比正常对照组显著降低(P<0.05);模型组与自然恢复组无显著性差异(P>0.05)。何首乌饮、何首乌丸组精子数量均高于模型组和自然恢复组(P<0.05),但各用药组之间无显著性差异(P>0.05);各用药组均能不同程度的提高精子活动度和存活率(P<0.01),其中何首乌饮高剂量组要好于其他各组(P<0.05)。4大鼠血清LH、FSH、睾酮和下丘脑GnRH浓度的变化:模型组大鼠血清LH、FSH和下丘脑GnRH浓度明显升高,睾酮浓度明显下降,与正常组比较差异有显著性(P<0.05),与自然恢复组无显著差异(P>0.05),何首乌饮、何首乌丸均能不同程度降低血清LH、FSH和下丘脑GnRH浓度,提高睾酮浓度(P<0.05);何首乌丸组好于何首乌饮低、中剂量组(P<0.05),而何首乌饮高剂量组疗效最佳(P<0.05)。5 HE染色显示正常组大鼠睾丸生精小管饱满,管壁厚,生精细胞丰富,腔内有大量精子,提示生精活跃;模型组大鼠睾丸生精小管管壁上皮变薄,生精细胞层次减少,排列紊乱,腔内出现脱落退化细胞,提示生精功能低下;用药组生精小管管壁增厚,可见各级生精细胞,腔内可见丰富精子。6 IGF-1 mRNA在睾丸间质细胞、精母细胞、精子细胞均有表达,免疫阳性产物分布在细胞质,呈棕黄色的弥散颗粒状。模型组与正常组相比明显降低(P<0.05);模型组与自然恢复组无差异(P>0.05);用药组均能提高睾丸IGF-1 mRNA的表达(P<0.01),何首乌饮高剂量组明显好于其他各组(P<0.05)。结论:1 D-半乳糖致衰老模型的建立是成功的。2何首乌饮可以明显改善D-半乳糖所致亚急性衰老大鼠睾丸的形态结构,提高精子数量、活动度和存活率,从而改善精子数量和精子功能。3何首乌饮可以提高D-半乳糖所致亚急性衰老大鼠血清雄性激素(睾酮)的水平,降低促性腺激素和促性腺激素释放激素的水平。4何首乌饮可以提高D-半乳糖所致亚急性衰老大鼠睾丸细胞局部调节因子IGF-1 mRNA的表达水平。第二部分何首乌饮对衰老雄性大鼠睾丸Rb/p53细胞信号转导通路的影响目的:通过检测大鼠睾丸组织Rb、p16、p53、p19、p21的表达,探讨何首乌饮对睾丸的抗衰老作用。方法:1采用免疫组织化学法检测大鼠睾丸组织pRb、p16、p53、p19、p21的表达情况。2 Western Blot法检测各组大鼠睾丸pRb、p16、p19、p21蛋白的表达。3 RT-PCR检测各组大鼠睾丸p53、Rb mRNA的表达。结果:1免疫组化染色:各组切片均可见pRb、p16、p53、p19、p21染色,免疫阳性细胞主要是精原细胞,偶见于精子细胞、间质细胞和生精小管基底膜肌原细胞。免疫阳性产物位于细胞核,通常呈棕黄色颗粒状,小部分呈弥散状。2 Western Blot检测睾丸组织pRb、p16、p19、p21蛋白的表达:模型组大鼠睾丸组织p16、p19、p21蛋白的表达水平明显升高,pRb蛋白表达水平明显下降,与正常组比较有显著性差异(P<0.05);与自然恢复组无差别(P>0.05);用药组睾丸组织p16、p19、p21蛋白的表达水平明显低于模型组,pRb蛋白表达水平明显高于模型组(P<0.05),其中何首乌饮高剂量组明显好于其余各组(P<0.05)。3 RT-PCR检测睾丸组织p53、Rb mRNA的表达:模型组睾丸组织p53、Rb mRNA的表达水平明显高于正常对照组(P<0.05),与自然恢复组无差异(P>0.05);用药组大鼠睾丸组织p53、Rb mRNA的表达水平明显低于模型组(P<0.05),其中何首乌饮高剂量组明显好于其余各组(P<0.05)。结论:1 pRb、p16、p53、p19、p21主要在睾丸精原细胞胞核表达。2衰老雄性大鼠睾丸组织p16/Rb和p19/p53/p21衰老途径中关键的调节因子p53、Rb mRNA基因及p16、p19、p21蛋白表达上调,用何首乌饮治疗可以起到抑制表达的作用;pRb蛋白表达下调,何首乌饮治疗可以起到促进表达的作用。综上所述,我们的研究表明何首乌饮通过(1)改善衰老大鼠睾丸生精功能;(2)调节衰老雄性大鼠睾丸组织Rb/p53细胞信号转导通路,从而达到改善大鼠睾丸生殖功能,延缓大鼠睾丸衰老的作用。