β-(1→3)-D-葡聚寡糖衍生物的设计合成、生物活性测定及寡糖芯片的构建

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糖生物学的研究领域主要包括糖缀合物糖链的化学合成与结构分析、糖缀合物糖链的生物合成、糖缀合物糖链在复杂生物系统中的功能,以及糖缀合物糖链操作技术。结构辅助并基于机理进行有目的药物设计,仍是当前药物设计的主流,它可以为糖生物学开辟一个新的领域。而糖芯片可以广泛地用于研究糖类,例如高通量分析糖-蛋白的相互作用、药物基因组学等,是后基因组时代必不可少的一种研究工具。本文的主要工作是研究了β-(1→3)-D-葡聚寡糖衍生物的设计合成、生物活性测定和寡糖芯片的构建。完成的工作主要包括以下几个方面:采用酸碱法来提取啤酒酵母中的β-(1→3)-D-葡聚糖。纸色谱和紫外光谱分析表明,所得产物为高纯度的β-(1→3)-D-葡聚糖,此结论由傅立叶红外(FTIR)光谱得到进一步的证实。这表明酸碱法是从啤酒酵母中提取β-(1→3)-D-葡聚糖的理想途径。荧光辅助糖电泳(FACE)是一种快捷、花费少的分离糖类方法。寡糖首先经8-氨基萘基-1,3,6-三磺酸(ANTS)胺化还原衍生,此反应过程在所给实验条件下需要16h。然后,ANTS衍生的寡糖在由32﹪丙烯酰胺-2.4﹪双丙烯酰胺组成的碱性分离胶上电泳从而得以分离。此方法无需专门的仪器和操作熟练的技术人员。实验结果表明,当糖的浓度范围在5~100pM之间时,带的荧光强度和糖的浓度之间成线性关系,并且没有哪个链长比其它的链长更加容易衍生化。用2.0mol/L的CF3COOH来水解酵母葡聚糖,得到的寡糖混合物经FACE分析,结果证实得到了聚合度为1-7的β-(1→3)-D-葡聚寡糖。根据β-(1→3)-D-葡聚糖酶的作用机理,设计出环氧烷基-β-(1→3)-D-葡聚寡糖。然后经过乙酰化、糖苷化、氧化和去乙酰化这四步来合成它。用ESI-MS分析了所得到的一产物。酶活性分析表明,在β-(1→3)-D-葡聚寡糖分子中引入环氧烷基后,的确能够提高其抗酶水解能力,并且所引入环氧烷基的链长越短,其抗酶水解能力越强。测定了β-(1→3)-D-葡聚寡糖及其3,4-环氧丁基衍生物对超氧阴离子自由基的清除作用、对动物免疫调节的影响、对单核细胞产生超氧阴离子的影响、对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖实验的影响,以及对植保素生成的影响。结果表明:①在0.1μg/mL这个浓度上,β-(1→3)-D-葡聚寡糖及其3,4-环氧丁基衍生物均对超氧阴离子有一定的清除作用;②在200μg/mL这个浓度上,β-(1→3)-D-葡聚寡糖及其3,4-环氧丁基衍生物对提高巨噬细胞吞噬功能均有显著作用;③在20μg/mL这个浓度上,β-(1→3)-D-葡聚寡糖及其3,4-环氧丁基衍生物均对人体单核细胞有较强的激活作用;④在200μg/mL这个浓度上,β-(1→3)-D-葡聚寡糖及其3,4-环氧丁基衍生物对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖有一定的促进作用;⑤在诱导植保素的生成过程中,β-(1→3)-D-葡聚寡糖的活性要比其3,4-环氧丁基衍生物稍低,且β-(1→3)-D-葡聚寡糖持续的时间要短,这表明β-(1→3)-D-葡聚寡糖的稳定性要比其3,4-环氧丁基衍生物差。用QDs作为荧光标记物,提供了一种灵敏、特效和快速的检测糖-蛋白质相互作用的方法。利用叠氮化合物和炔之间发生1,3-偶极环加成来将α-D-吡喃葡萄糖连接到能够非共价吸附到微孔板孔的表面上的C14碳链上,生成的产物用ESI-MS和QD(或FITC)标记的凝集素来检测。结果表明,峰强度随着QD-ConA浓度(2×10-3μmol/L-2×10-2mmol/L)的增加而增加,并且基于QD标记方法的灵敏度至少比基于FITC标记方法高100倍。
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