衰老相关神经损伤类疾病,因各种原因导致神经细胞缺失和神经组织受损,又因机体衰老难以自体恢复,而造成患者的长期运动和认知功能障碍。此类疾病的发病率和危险系数随年龄的增长而增大,不仅对家庭也对当今老龄化社会带来巨大压力。神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)不仅可以自我更新以维持干性,还可分化为多种神经细胞,维持脑内稳态,因此是神经修复与再生的良好工具。但NSCs的数量和增殖能力随机体老化而降低,使衰老机体神经发生减少。现代生物学研究中,无论移植外源性NSCs对内补充,还是给予营养因子等药物调控内源性NSCs启动修复,都尚未达到令人满意的临床效果。中医理论认为大脑的强健与肾精的充足和肾气的充盈密切相关,脑为髓海,肾藏精为生髓之所。并且,肾精与解剖学概念的NSCs具有相通性,NSCs可能是肾精在脑部的细胞存在形式。熟地黄可益精充髓,被历代中医推崇为益肾之药,但其促NSCs增殖的活性及药效物质基础目前尚无明确报道。本课题的研究结果将为熟地黄及其活性成分在临床发挥衰老神经修复与再生作用奠定基础。本课题以原代培养的NSCs为细胞来源,以CCK-8细胞活性检测结果为增殖判断指标,对11味补肾益精中药的活性进行了初步筛选,并选择活性明显但药效物质基础尚不明确的补肾要药熟地黄作为研究对象。同时,以CCK-8检测结果为活性指标,结合多种化学分离手段,对熟地黄促正常NSCs增殖的活性组分进行活性追踪,缩小筛选范围。最后,利用D-半乳糖诱导建立NSCs体外衰老模型,借此进一步确定熟地黄促衰老NSCs增殖的活性部位,并鉴定了其中的50个成分。通过对地黄中几个特征性化学物质促衰老NSCs增殖作用的研究,发现源于熟地黄活性部位的毛蕊花糖苷活性最强。实验研究共分三章,简述如下:第一章:从15 d～17 d胎鼠大脑中机械分离获得原代海马NSCs,使用添加了 bFGF和B27的无血清培养基进行悬浮培养和传代,成功获得纯度达95%的NSCs。借助CCK-8绘制了 NSCs的生长曲线,发现NSCs接种后24 h处于潜伏期,24 h～96 h为对数生长期,96h后进入平台期。基于以上结果,对鹿茸、菟丝子、熟地黄、牛膝、枸杞子、巴戟天、酒肉苁蓉、黄精、炙淫羊藿、山茱萸、制何首乌11味补肾益精中药作用于NSCs的效果进行研究,发现均具有明显的促进NSCs增殖的活性(P<0.01)。此结果为中医“肾脑相关”理论提供细胞学支持,也为神经修复的中药开发提供指引,为本课题选择熟地黄为研究对象提供依据。第二章:以化学手段为分离工具,以CCK-8检测结果为活性指标,对熟地黄促NSCs增殖的活性组分进行层层筛选,以缩小目标范围。通过溶剂萃取和水提醇沉制得熟地黄的石油醚部位(SDE-Pe)、乙酸乙酯部位(SDE-Ea)、正丁醇部位(SDE-nB)、剩余水部位(SDE-W)和多糖部位(SDW-P),并从中筛选出SDE-Ea和SDE-nB为主要活性组分。利用大孔树脂、ODS和凝胶柱色谱对SDE-nB进行分离,从中进一步筛选出nB-CX-N3为主要活性组分。利用硅胶柱色谱对SDE-Ea进行分离,从中进一步筛选出Ea-GX为主要活性组分。最终得到熟地黄促NSCs增殖的主要活性组分为nB-CX-N3和Ea-GX,为熟地黄抗衰老的有效组分研究缩小筛选范围。第三章:通过对D-半乳糖作用时间(6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h)和作用浓度(100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.50 mg/mL、6.25 mg/mL、3.13 mg/mL、1.56 mg/mL、0.78 mg/mL、0.39 mg/mL、0.20 mg/mL)进行考察,成功建立本课题所需的NSCs体外衰老模型,即12.50 mg/mLD-半乳糖给药24 h。基于上述模型,对筛选得到的nB-CX-N3和Ea-GX抗衰老活性进行研究,发现促衰老NSCs增殖的最佳活性组分为 nB-CX-N3。为了揭露 nB-CX-N3 的化学本质,借助 UPLC-QE-Orbitrap-MS/MS 对其进行解析和归纳,从中解析了 50个抗衰老的潜在成分,并推测苯丙素及其衍生物可能是熟地黄抗衰老的结构基础。最后对地黄中各结构类型的代表成分梓醇、地黄苷D、毛蕊花糖苷、水苏糖、甘露三糖和蜜二糖促衰老NSCs增殖活性进行研究,发现梓醇、毛蕊花糖苷和低浓度水苏糖具有显著活性,其中毛蕊花糖苷促D-半乳糖所致衰老NSCs增殖效果最佳,间接的支持了熟地黄的活性追踪结果。本研究表明具有补肾益精作用的中药确有促NSCs增殖的作用,从细胞层面验证了中医学“肾脑相关”理论。采用细胞活性追踪方法,寻找到了熟地黄促衰老NSCs增殖的主要活性部位并鉴定了其中50个成分,其中的毛蕊花糖苷作用较强。本课题为熟地黄在临床中治疗衰老相关神经损伤类疾病提供了细胞学依据,为地黄及其主要有效成分应用于临床奠定了基础。