动脉粥样硬化是世界范围内致死致残的首要原因,其血管损害进程由早期的脂肪条纹逐渐进展为粥样斑块。动脉粥样硬化的病理机制是循环系统中炎症因子和多种血管壁内细胞(内皮细胞、单核细胞、淋巴细胞、血管平滑肌细胞)复杂的交互作用的结果,其特征性表现为动脉内膜变厚、炎症细胞和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)积累以及细胞外脂质和纤维素沉积。近年来,不断累积的研究证据表明,在动脉粥样硬化斑块的初始期、进展期和最终破裂时期,血管平滑肌细胞的结构和功能是不同的。血管平滑肌细胞拥有显著的可塑性,能够可逆的后天发育的表型。内皮细胞功能异常、机械或血流动力学压力以及炎症引起的血管损伤,促使血管平滑肌细胞从一种正常的、静止的、有收缩性的状态转变为一种活跃合成的表型,控制收缩功能的基因收到抑制,促进增殖、迁移、炎症的基因被诱导,导致大量的细胞外基质、细胞因子和蛋白酶合成。除了大量的增殖和迁移外,合成型的血管平滑肌细胞表达大量的极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白和清道夫受体,这些促进了不正常的脂质摄取和泡沫细胞形成,最终动脉粥样硬化开始形成。由于血管平滑肌细胞表型调控在动脉粥样硬化损害的起始、进展以及最后破裂非常重要,寻找促进其以上转变的分子靶点可能为动脉粥样硬化的治疗提供新的方法,以最终较少脑卒中的发生率。血管生成是动脉粥样硬化过程中一个显著的特征,内膜的血管新生更多的来自于邻近斑块的动脉外膜稠密血管网状结构,而不是主要血管内膜新生血管在斑块代谢活动中扮演了活跃的角色,使其生长超出了动脉内腔扩散的关键限值。随后,新生血管的固有弱点导致动脉斑块内出血以及不稳定性增加。通过对有症状的病人血管内膜切除术后进行组织学抗CD34染色,表明新增的血管分布和斑块内出血有很强的相关性。这些新生血管形成的不规则性表明其与正常组织创伤修复的血管新生是不同的。斑块相关内皮细胞活跃,伴随着单核细胞和巨噬细胞的增多以及粘附因子的表达增加,他们至少部分诱导了斑块形成过程中的炎症反应。动脉粥样硬化病变中细胞成分的凋亡增加了脂质体的形成,使纤维帽变薄,减少了间质胶原纤维的联系(由于平滑肌细胞的凋亡),产生有漏洞的微血管(内皮细胞的凋亡),最终导致斑块破裂及斑块内出血。microRNAs微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一组小的非编码RNA(20-25个核苷酸),它们对转录后基因的表达、调控以及多重信号通路(包过细胞分化、增殖、平衡以及器官发育)的整合非常重要。微小核糖核酸是高度保守的非编码RNA,他通过调节基因表达的抑制,最终抑制蛋白质的翻译。他们通过平衡细胞的增殖和分化在肿瘤生成和器官发育的细胞进程的起到关键调控作用成熟的微小RNA结合到RNA诱导的沉默复合体中,复合体引导到微小RNA与目标的信使RNA (mRNA)结合,最终抑制其翻译为蛋白质。到2012年,已有超过600人类]microRNA被发现,这些nicroRNA参与的大约50%人类编码蛋白的调控。据估计,人类基因组中1%到4%是microRNA,而一条microRNA能调控多达200个mRNA。一条microRNA有能力调控多个基因是由于它能以不完全的或完全的配对结合的mRNA的对应靶点上。越来越多的证据表明microRNA在许多重要的生物学进程中扮演着关键作用,例如细胞生长、器官分化、细胞增殖、胚胎发育、凋亡、细胞信号网络通路、不同物种基因表达变化以及转录因子的调控。COL1A2COL1A2是编码I型胶原α2链的基因,在大多数结缔组织中均存在此胶原纤维。在这个基因的突变与成骨不全症,Ehlers-Danlos综合征,特发性骨质疏松症,和非典型马凡综合征紧密相关。但是,此基因的突变相关的症状往往比在基因α-1型突变的Ⅰ型胶原相对较轻,因为a-2是低丰度。这个基因的多重信号由多聚腺苷酸化信号引发,这个特征和大多数其他胶原蛋白基因一样。血管壁同时含有Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白,这两种胶原蛋白在维持血管壁的完整性、可塑性以及抗压性中发挥有重要作用。多年前就有研究表明,在颅内动脉血管壁的构成中,Ⅰ型胶原蛋白与弹性纤维相伴随分布于平滑肌细胞的表面,说明Ⅰ型胶原蛋白在保证颅内血管壁的完整性及可塑性方面发挥更重要的作用。在人体的多种组织中,尤其是血管壁,可以发现Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白同时表达,而且两种胶原蛋白可形成特异性的纤维。血管壁的弹性通常与Ⅲ型胶原蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的构成比例有关,一般来说,当Ⅰ型胶原蛋白所占比例升高后,两种构成的胶原纤维将会增粗,血管壁的弹性将会下降,从而容易引起血管瘤的形成或者血管的破裂。KLF4Kruppel样因子4(KLF4)是转录因子Kruppel样因子家族的一员,它在增殖、分化、凋亡以及体细胞的重编程中扮演了重要角色,有证据表明,klf4同时还是某些癌症的肿瘤抑制因子,例如大肠癌。在胚胎干细胞中,klf4已被证明是一种良好的干细胞样能力的标志物,在骨髓间充质干细胞中,也同样能作为标志物。以往的研究发现,klf4对动脉粥样硬化炎症进程具有促进和抑制的双向调控作用：一方面血管内皮细胞klf4的过度表达会促进多种抗炎抗血栓因子表达,例如如内皮细胞型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)、血栓调节蛋白,从而产生抗炎、抗血栓的作用；另一方面klf4的过度表达能激活一系列促进炎症的细胞因子表达增加,例如肿瘤坏死因子,IL-10L、趋化因子CXCL5,单核细胞集落刺激因子(granulo-cyte colony-sfimuhting factor, GCSF)等,从而起到促进炎症加速动脉粥样硬化的作用。本研究自2013年1月起,我们研究组利用基因芯片技术已对高血压脑卒中miRNAs表达谱进行了初步分析,筛选出差异表达miRNAs,证实这是一个可行的研究方法。本研究主要内容包括两部分：第一部分,利用基因芯片技术研究高血压脑卒中患者血浆与一般高血压患者血浆中差异性miRNAs表达谱,筛查差异性表达的MiRNAs,并进行RT-PCR验证基因芯片分析的结果。第二部分：使用相关软件对经筛查差异表达的miRNA的下游靶基因进行预测,并使用RT-PCR进行基因表达量的半定量分析验证筛选出来的靶基因。实验目的：1研究高血压脑卒中患者血浆与高血压患者血浆中差异性miRNAs表达谱,筛查差异表达的miRNAs。2预测差异表达的miRNA下游的靶基因,并初步验证靶基因表达。实验内容与方法。1血浆样本的采集和储存2采用Norgen血浆/外泌体RNA提取试剂提取血浆总RNA。3采用microRNA芯片筛选出病例组、对照组血浆特异性miRNAs,采用相关软件和统计学方法将得到的miRNA表达谱数据进行分析。4 RT-PCR验证血浆中差异表达的miRNA.5登入互联网使用miRNA靶基因预测软件MiRanda、Targetscan、Pictar,预测差异表达miRNA的靶基因,并根据基因功能进行筛选。6 RT-PCR验证以上预测的靶基因。实验结果：1. miRNAs基因芯片筛选出9个差异性表达的miRNAs,在脑卒中病人中其中6条表达下降,3条表达升高。3个上调的miRNAs中无上调超过2倍(即Log2 (G1/G2)≥1)的miRNAs;下调大于2倍(Log2 (G1/G2)≤(-1))的hsa-miRNAs有3个:hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-3 Oc-5p、hsa-miR-5195-3p,其中以has-miR-29a-3p下调倍数最大。2基因芯片RT-PCR验证结果中,hsa-miR-29a-3p下调倍数超过2倍,hsa-miR-30c-5p和hsa-miR-5195-3p下调倍数未超过2倍,但是上升下调的趋势与芯片结果保持相同,提示RT-PCR结果与芯片结果大体保持一致,其中以hsa-miR-29a-3p可靠性最高。3生物信息学分析结果筛选出hsa-miR-29a-3p下游103个可疑的靶基因,通过查阅文献中相关基因功能,选取了COL1A2和klf4两个与本研究紧密相关的基因。4靶基因RT-PCR验证结果,两组两基因的CT值分别采用2-△△Ct方法进行数据分析,结果显示病例组明显较对照组降低(P<0.05),即病例组样本中COL1A2和klf4两基因的初始量较对照组高,两组之间有统计学意义。实验结论：1高血压人群中发生脑卒中的病人与未发生脑卒中的人员血浆miRNAs表达谱存在差异,我们共发现9条有差异性表达的miRNAs,在脑卒中病人中其中6条表达下降,3条表达升高。2在miRNAs表达谱中,miR-29a-3p的改变最为显著,它可以作为分子生物学标志用来筛查高血压患者中易发生脑卒中的高危人群,同时miR-29a-3p可能参与了高血压患者脑卒中发生发展的病理过程。3脑卒中患者中miR-29a-3p表达量下降,可能减少了对其下游靶基因COL1A2的抑制,从而使后者表达增加,使颅内动脉血管壁的I型胶原蛋白所占比例升高,从而引起胶原纤维增粗、血管壁弹性降低,进而引起血管的破裂出血。4脑卒中患者中miR-29a-3p表达量下降,可能减少了对其下游靶基因klf4的抑制,从而使后者表达增加,其表现以促进炎症作用为主,诱导TNF、IL-10L、趋化因子CXCL5、单核细胞集落刺激因子等炎症介质产生,从而加速动脉粥样硬化进程。