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目的观察下丘脑腹内侧核(VMH)与海马CA1区之间Nesfatin-1神经/功能通路构成,探讨下丘脑腹内侧核Nesfatin-1对正常大鼠及糖尿病大鼠胃牵张敏感神经元放电活动和胃运动的影响及其潜在机制,阐明海马CA1区对下丘脑腹内侧核Nesfatin-1调控的效应。方法选用成年Wistar雄性健康大鼠782只,体重250-300 g,分笼饲养,每笼5只,实验处理后单笼饲养,大鼠食物皆为标准颗粒饲料,动物房保持22±3℃温度,60±5%的相对湿度,昼夜循环光照为12 h:12 h。实验前大鼠适应性饲养1周。主要实验方法包括糖尿病大鼠模型制备、单个神经元细胞外放电记录、荧光金逆行追踪实验、免疫组织化学染色、在体胃运动记录实验、核团电刺激和电损毁。选取400只大鼠制备糖尿病大鼠模型,造模前大鼠禁食12小时,不禁水。给予模型组大鼠腹腔注射35 mg/kg 1%的链脲佐霉素(STZ)溶液,第一次注射后饲养一周,第8天以同样的方式同等剂量进行第二次腹腔注射。采取大鼠尾尖血液测量大鼠空腹血糖值,实验选取空腹血糖≥7.8 mmol/l,以及餐后血糖≥11.1 mmol/l的大鼠作为糖尿病大鼠模型。实验中共筛选出糖尿病模型大鼠364只。单个神经元细胞外放电记录观察下丘脑腹内侧核Nesfatin-1对大鼠胃牵张敏感神经元放电活动的影响;荧光金逆行追踪结合荧光免疫组织化学染色观察下丘脑腹内侧核与海马CA1区之间Nesfatin-1神经元纤维联系;核团电刺激和电损毁实验观察海马CA1区对下丘脑腹内侧核Nesfatin-1效应的调控作用;在体胃运动记录实验观察下丘脑腹内侧核Nesfatin-1对大鼠胃运动的调控。结果1.单个神经元细胞外放电记录研究显示,55只正常大鼠下丘脑腹内侧核的细胞外神经元放电共记录到176个神经元,其中118个(118/176,67.0%)神经元对胃扩张刺激产生反应,鉴定为胃牵张(GD)敏感性神经元。在这118个GD敏感性神经元中,包括61个GD兴奋性(GD-E)神经元和57个GD抑制性(GD-I)神经元。在61个GD-E神经元中,下丘脑腹内侧核微量注射Nesfatin-1,有16个(16/61,26.2%)神经元显示为抑制效应,8个GD-E神经元显示为兴奋效应(8/61,13.1%),37个神经元无明显变化(37/61,60.7%);57个GD-I神经元中,下丘脑腹内侧核注射Nesfatin-1,其中有12个(12/57,21.1%)神经元显示为兴奋效应,7个神经元显示为抑制效应(7/57,12.3%),38个神经元无明显变化(38/57,66.6%)。预先下丘脑腹内侧核注射促肾上腺皮质激素受体拮抗剂astressin-B,再注射Nesfatin-1,则Nesfatin-1调控GD-E或GD-I神经元放电效应明显减弱(P<0.05)。相比正常大鼠,胃扩张刺激后,糖尿病大鼠下丘脑腹内侧核记录到的GD-E或GD-I神经元在GD神经元中的比例,以及其放电频率无明显差异(P>0.05),但糖尿病大鼠下丘脑腹内侧核注射Nesfatin-1,其抑制GD-E神经元放电的比率明显升高(26.01%VS.38.52%,P<0.05),放电频率变化率也显著增加(34.25±5.02%VS.57.17±9.23%,P<0.05);其兴奋GD-I神经元放电的比率明显增加(21.55%VS.33.39%,P<0.05),放电频率变化率也显著升高(26.82±7.21%VS.38.23±6.25%,P<0.05)。在糖尿病大鼠,下丘脑腹内侧核预先注射astressin-B,Nesfatin-1对GD-E或GD-I神经元放电频率变化率的调控较正常大鼠更为显著(P<0.05)。2.在体胃运动实验结果显示,不同浓度Nesfatin-1可使正常大鼠胃收缩幅度和收缩频率显著降低,且呈显著量效依赖关系(P<0.05~0.01)。下丘脑腹内侧核微量注射Nesfatin-1约5min后胃收缩幅度开始下降,约在10-15min下降幅度达到峰值。预先下丘脑腹内侧核注射astressin-B,可部分阻断Nesfatin-1抑制胃运动效应(P<0.05)。在糖尿病大鼠,下丘脑腹内侧核注射不同剂量的Nesfatin-1,大鼠胃收缩幅度和频率均显著降低,且呈显著剂量依赖关系(P<0.05~0.01)。与正常大鼠相比,糖尿病大鼠下丘脑腹内侧核给予相同剂量Nesfatin-1,胃运动指数降低程度更为显著,差异具有统计学意义(P<0.05)。进一步研究显示,下丘脑腹内侧核注射不同浓度Nesfatin-1,糖尿病大鼠胃运动指数的EC50Nesfat in-1显著低于正常大鼠EC50Nesfat in-1(P<0.05)。3.荧光金逆行追踪结合荧光免疫组化实验显示,下丘脑腹内侧核注射荧光金7天后,在海马CA1区发现有荧光金标记的神经元,结合Nesfatin-1荧光免疫组化研究,镜下可见海马CA1区部分标记荧光金的细胞质内有Nesfatin-1免疫阳性活性物的表达。提示,海马CA1区部分Nesfatin-1神经元可发出纤维投射至下丘脑腹内侧核。4.电刺激正常大鼠海马CA1区,可兴奋下丘脑腹内侧核Nesfatin-1抑制性GD-E神经元和Nesfatin-1兴奋性GD-I神经元;预先下丘脑腹内侧核注射抗NUCB2/Nesfatin-1抗体,再电刺激海马CA1区,Nesfatin-1抑制性GD-E神经元的兴奋效应进一步增强(P<0.05),而Nesfatin-1兴奋性GD-I神经元的兴奋效应进一步减弱(P<0.05)。在糖尿病大鼠,电刺激海马CA1区,可兴奋下丘脑腹内侧核Nesfatin-1抑制性GD-E神经元和Nesfatin-1兴奋性GD-I神经元;下丘脑腹内侧核微量注射抗NUCB2/Nesfatin-1抗体,再电刺激海马CA1区,Nesfatin-1抑制性GD-E神经元的兴奋效应也进一步增强(P<0.05),而Nesfatin-1兴奋性GD-I神经元的兴奋效应也进一步减弱(P<0.05)。与正常大鼠比较,下丘脑腹内侧核注射抗NUCB2/Nesfatin-1抗体,电刺激海马CA1区,糖尿病大鼠Nesfatin-1抑制性GD-E神经元的兴奋效应显著高于正常大鼠(P<0.05),而Nesfatin-1兴奋性GD-I神经元的兴奋效应显著低于正常大鼠(P<0.05)。5.电刺激海马CA1区,正常大鼠胃收缩幅度和收缩频率显著增加(P<0.05),约13min时达到高峰。大鼠下丘脑腹内侧核微量注射抗NUCB2/Nesfatin-1抗体,再电刺激海马CA1区,大鼠胃收缩幅度和频率进一步增强(P<0.05)。糖尿病大鼠,下丘脑腹内侧核注射抗NUCB2/Nesfatin-1抗体,再电刺激海马CA1区,大鼠胃收缩幅度和频率也显著增强(P<0.05)。但与正常大鼠相比,糖尿病大鼠下丘脑腹内侧核注射抗NUCB2/Nesfatin-1抗体后再给予电刺激海马CA1区,胃运动指数虽有所升高,但差别无统计学意义(P>0.05)。6.电损毁海马CA1区,正常大鼠下丘脑腹内侧核GD-E或GD-I神经元放电频率无明显变化(P>0.05)。但与假损毁对照组相比,电损毁海马CA1区,下丘脑腹内侧核注射Nesfatin-1,对GD-E敏感神经元放电频率抑制作用和对GD-I敏感神经元放电频率兴奋作用均显著减弱(P<0.05)。在体胃运动研究显示,电损毁海马CA1区对大鼠胃收缩幅度和频率无显著影响(P>0.05);与假损毁+Nesfatin-1组相比,电损毁海马CA1区后大鼠下丘脑腹内侧核注射Nesfatin-1,大鼠胃收缩幅度和频率也无显著改变(P>0.05)。在糖尿病大鼠,电损毁海马CA1区,下丘脑腹内侧核GD-E或GD-I神经元放电频率无明显变化(P>0.05)。与假损毁+Nesfatin-1组相比,电损毁海马CA1区,下丘脑腹内侧核注射Nesfatin-1对GD-E敏感神经元放电频率抑制作用和对GD-I敏感神经元放电频率兴奋作用均显著减弱(P<0.05)。在体胃运动研究结果显示,与假损毁+Nesfatin-1组相比,电损毁海马CA1区,下丘脑腹内侧核注射Nesfatin-1,糖尿病大鼠胃收缩幅度和频率均无显著改变(P>0.05)。与正常大鼠相比,电损毁海马CA1区,糖尿病大鼠下丘脑腹内侧核注射Nesfatin-1,Nesfatin-1对GD-E敏感神经元放电频率抑制作用和对GD-I敏感神经元放电频率兴奋作用虽有减弱,但差异无统计学意义(P>0.05)。与正常大鼠相比,电损毁海马CA1区,或电损毁海马CA1+VMH注射Nesfatin-1,糖尿病大鼠胃运动指数均无显著改变(P>0.05)。结论海马CA1区与下丘脑腹内侧核间有Nesfatin-1神经纤维联系;海马-下丘脑Nesfatin-1信号通路参与胃传入信息和胃运动调控,该作用可能与CRF系统活动有关;下丘脑Nesfatin-1可能参与糖尿病胃传入信息和动力障碍的调控;海马学习记忆中枢参与下丘脑摄食相关中枢Nesfatin-1对胃传入信息相关神经元兴奋性和胃运动的调控;本研究为胃肠功能紊乱相关疾病的诊断和治疗提供了理论依据和治疗靶点。