鳃裂-耳-肾综合征（Branchio-oto-renal syndrome，BOR）是一种罕见的常染色体显性遗传性疾病，主要表现为鳃弓发育异常，听力障碍和泌尿系统畸形，在儿童中的发病率为1：40000，在深度聋儿中占2％。随着分子生物学的发展，人们已经定位和克隆出了BOR综合征的2个致病基因，EYA1基因和SIX1基因，他们分别是果蝇眼发育基因eya（Drosopbila eyes absent gene）和so（sine oculis）的同源基因。1999年KennethR．Johnson等人报道了C3H／HeJ小鼠基因自发突变出现了听力损失及兜圈（circling）的症状，病理检查发现该突变小鼠内耳发育畸形以及肾脏畸形或者缺失。通过对该突变小鼠的基因链锁定位发现突变位于1号常染色体Eya1基因，从而以该突变小鼠作为BOR综合征的动物模型，进行进一步研究发现这种突变小鼠的Eya1基因的7号内含子中插入了一个IAP（Intracisternal A Particle）。由于这种插入会导致Eya1基因转录的正常的mRNA量减少以及一些异常的mRNA的形成，从而导致由Eya1基因编码的蛋白量减少。当Eya1基因为纯合突变，其编码的蛋白量低于正常发育所需要的蛋白量，小鼠出现表型；当Eya1基因为杂和突变，其编码的蛋白量仍能满足正常发育的需要，小鼠则不出现表型，也正好解释了这种突变在该小鼠里的隐性遗传特征。更进一步的研究发现，Eya1^bor／bor突变鼠的基因表现度，例如产后死亡率和听力障碍的程度，随着小鼠基因背景的不同而存在着很大的差异，所以人们推测在某些鼠种的基因组里存在着Eya1基因的遗传修饰基因。JenniferA．Floyd等人用C3HeB／FeJ小鼠与CAST／EiJ小鼠杂交，得到Eya1^bor／bor基因型的后代，再通过数量性状基因位点（Quantitative trait loci，QTL）分析，发现了一个调节基因Nxf1（nuclear export factor）可以减少带有Eya1^bor／bor基因型的杂交小鼠的死亡率和听力障碍程度，并且发现Nxf1基因是通过增加正常Eya1 mRNA的量来发挥作用。那么Eya1基因是否还存在其他的遗传修饰基因?其他的遗传修饰基因又如何对Eya1基因进行调节?本课题以C3HeB／FeJ-Eya1^bor/+小鼠与C57BL／6J小鼠，CAST／EiJ小鼠，以及BALB／cJ小鼠杂交而得到的三种不同基因背景小鼠为研究对象，对各种杂交小鼠基因组的基因型进行检测。选择小鼠ABR值和耳蜗周数的变化作为BOR综合征表型的2个指标，运用QTL分析将基因型与表型进行关联分析，再建立小鼠同类系进行精确定位的方法来定位Eya1基因的遗传修饰基因。本课题为克隆Eya1^bor／bor基因的遗传修饰基因和研究各个基因的功能奠定基础，并且为研究人类综合征型耳聋的调节基因提供思路。本文共分五个部分。第一部分C3HeB／FeJ-Eya1^bor／+小鼠与C57BL／6J小鼠，CAST／EiJ小鼠第二代杂交小鼠的培育[目的]培育具有不同基因背景的杂交小鼠，为研究Eya1基因的遗传修饰基因奠定基础。[方法]用C3HeB／FeJ-Eya1^bor／+小鼠分别与C57BL／6J小鼠，CAST／EiJ小鼠杂交得到两种不同基因背景的第一代杂交小鼠（F1），再通过互交（intercross）得到第二代杂交小鼠（F2），通过PCR检测所有F2的Eya1基因位点的基因型。[结果]C3HeB／FeJ-Eya1^bor／+×C57BL／6J F2共2255只，其中基因型为Eya1^bor／borF2 267只，Eya1^bor／+F2 1342只，Eya1^+／+F2 646只；C3HeB／FeJ-Eya1^bor／+×CAST／EiJ F2共1000只，其中基因型为Eya1^bor／borF2 178只，Eya1^bor／+F2 570只，Eya1^+／+F2 252只。[结论]部分基因型为Eya1^bor／borF2出现明程度不等地点头兜圈等症状，部分基因型为Eya1^bor／borF2的症状并不明显，说明C57BL／6J小鼠和CAST／EiJ小鼠的某些基因位点对Eya1^bor／borF2的耳部发育发挥了作用。第二部分以基因型为Eya1^bor／bor的第二代杂交小鼠的ABR值和耳蜗周数的变化为指标初步定位Eya1基因的遗传修饰基因[目的]初步定位Eya1基因的遗传修饰基因位点。[方法]分别以267只和178只基因型为Eya1^bor／bor的第二代杂交小鼠为研究对象，剪取小鼠小块耳阔消化后提取小鼠基因组DNA，用染料标记的简单序列长度多态性标记（dye-labeled SSLP marker）对基因组DNA进行检测，以代表小鼠基因型，标记间距约为25cM，总共选取98个标记位点。将ABR值划分为14个等级，对每只小鼠进行ABR检测确定其听力等级。运用Map Manager QTXb20软件对每个标记位点与其听力变化的相关性进行QTL分析。解剖取出小鼠内耳，记录其耳蜗周数，运用MapManager QTXb20软件对每个标记位点与其耳蜗周数变化的相关性进行QTL分析。[结果]1．C3HeB／FeJ×C57BL／6J F2 52％（139／267）的F2-Eya1^bor／bor至少有一只耳朵的ABR值小于90db，其听力变化范围为35-90db。QTL分析得到2组标记与小鼠听力变化相关联，位于4号染色体上的标记D4Mit104与小鼠听力变化的相关性最强，其LOD值（logarithm ofthe odds oflinkage，LOD）为12．0，能解释其听力变化的19％。本课题组将该标记指示的位点命名为Mead1（Modifier of Eya1-associated deafness1）。位于12号染色体上的标记D12Mit283与小鼠听力变化的相关性强，其LOD值为12．1，能解释其听力变化的19％，该位点命名为Mead2。记录的89只F2的耳蜗周数变化范围从0周到1 3/4周，与耳蜗周数变化相关性强的两个标记也是D4Mit104和D12Mit283，其中D4Mit104的LOD值分别是15．8，能解释其耳蜗周数变化的58％。D12Mit283的LOD值是3．3，能解释耳蜗周数变化的16％。2．C3HeB／FeJ×CAST／EiJ F2 86％（153／178）的F2-Eya1^bor／bor至少有一只耳朵的ABR值小于90db，其听力变化范围在90dB-30dB，QTL分析没有发现其听力变化与任何标记位点有明显的相关性。[结论]1．Mead1和Mead2两个位点内有基因对Eya1^bor／bor基因具有修饰作用，这两个位点可以提高Eya1^bor／bor基因型小鼠的听力并且可以促进小鼠耳蜗发育。2．C3HeB／FeJ×CAST／EiJ F2可能有多种因子发挥调节作用或者以互交的方式得到的F2的表型与基因型的相关性不强，所以用回交的方式培育C3HeB／FeJ×CAST／EiJF2，再进行听力变化和耳蜗周数变化与小鼠基因型的相关性分析。第三部分回交培育C3HeB／FeJ×CAST／EiJ第二代杂交小鼠N2定位Eya1基因的遗传修饰基因[目的]初步定位Eya1基因的遗传修饰基因位点。[方法]随机选取C3HeB／FeJ-Eya1^bor／+×CAST／EiJ小鼠第一代杂交小鼠F1 35只与C3HeB／FeJ-Eya1^bor／+小鼠回交得到Eya1^bor／bor基因型的第二代杂交小鼠N2，对N2-Eya1^bor／bor进行基因型的检测，听力等级的测定和记录耳蜗周数，QTL分析表型与基因型的相关性。方法同本文第二部分。[结果]1．C3HeB／FeJ×CAST／EiJ N2共909只，基因型为Eya1^bor／borN2 179只，Eya1^bor／+N2470只，Eya1^+／+N2 260只。2．62％（112／179）的N2至少有一只耳朵的ABR值小于90 dB，其听力变化范围在90 dB-40 dB。根据第二部分的结果，44％（67／153）F2的ABR值（?）50 dB，而只有17％N2 ABR值（?）50 dB。通过QTL分析共发现4组标记与之关联，标记D4Mit149与N2的听力变化关联性最强，LOD值为8．4，可解释听力变化的19％，该位点与Mead1位点重合；标记D19Mit28与其也有很强的关联性，LOD值为8．1，可解释听力变化的19％；标记D9Mit126和D15Mit242也与听力变化相关联，LOD值分别为2．4和2．7，分别解释听力变化的6％和7％。记录89只N2耳蜗周数，发现3组标记与耳蜗周数相关联，标记D4Mit104与耳蜗周数的关联性最强，LOD值为4．5，可解释耳蜗周数变化的21％，该位点与Mead1位点重合；标记D12Mit218与其关联的LOD值为2．8，可解释耳蜗周数变化的14％，该位点与Mead2位点重合；标记D14Mit174与其关联的LOD值为3．3，可解释耳蜗周数变化的16％。[结论]1．标记D4Mit149和标记D4Mit104是4号染色体上相邻的两个遗传学标记，说明C57BL-／6J和CAST／EiJ这两个不同鼠种在Mead1位置有相同或者同系列基因对Eya1基因发挥调节作用法，该位点能提高小鼠听力和促进耳蜗发育。2．标记D12Mit218和标记D12Mit283是12号染色体上相邻的两个遗传学标记，说明C57BL／6J和CAST／EiJ这两个不同鼠种在Mead2位置有相同或者同系列基因对Eya1基因发挥调节作用，其作用主要是促进耳蜗发育。3．命名标记D19Mit28所指代的位置为Mead3，已经报道的Eya1调节基因Nxf1位于该范围内。第四部分建立同类系进一步精确定位遗传修饰基因位点Mead1和Mead2位置[目的]分别建立以C3HeB／FeJ小鼠的基因组DNA为基因背景，在Mead1和Mead2位点被C57BL／6J小鼠基因替代的同类系各一个，进一步缩小位点Mead1和Mead2的范围[方法]Mead1位点为C57BL／6J的C3Fe．B6同类系小鼠的培育：C3HeB／FeJ×C57BL／6J F1与C3HeB／FeJ-Eya1^bor／+回交，再将得到的基因型为Eya1^bor／+N2用染料标记的简单序列长度多态性标记进行基因组DNA检测，选择2—3只基因型为Eya1^bor／+，Mead1位点为杂合位点，而其他位点为杂合位点数目最少的雄性小鼠为种鼠，与其父代回交进行下一代的繁殖，同类系在经过五代繁殖之后建立。本课题选择第五代同类系小鼠作为试验对象。Mead2位点为C57BL／6J的C3Fe．B6同类系小鼠的培育方法同上。对所有Eya1^bor／bor基因型小鼠均进行基因组DNA检测，并计取所有的同类系小鼠的耳蜗周数。[结果]1．对每一代Eya1^bor／bor杂交小鼠进行听力检测发现，随着C57BL／6J小鼠基因在杂交小鼠基因组内的减少，Mead1和Mead2位点抑制Eya1^bor／bor基因型杂交小鼠听力障碍的功能逐渐减弱。2．当Eya1^bor／bor杂交小鼠在标记D4Mit149和D4Mit193（Mead1位点内）之间为C57BL／6J和C3HeB／FeJ等位基因杂合时，Eya1^bor／bor基因型小鼠（14只）持续存在有1/2-3/4圈耳蜗；当其在该位置为C57BL／6J等位基因纯合时，Eya1^bor／bor基因型小鼠（11只）持续存在有1-1 1/4圈耳蜗。3．当Eya1^bor／bor杂交小鼠在标记D12Mit103和D12Mit172（Mead2位点内）之间为C57BL／6J和C3HeB／FeJ等位基因杂合时，只有6％（4／25）Eya1^bor／bor基因型杂合小鼠持续存在有多于1/4圈耳蜗，其余没有耳蜗发育；当其在该位置为C57BL／6J等位基因纯合时，所有Eya1^bor／bor基因型小鼠持续存在有1／2-3／4圈耳蜗。[结论]1．Mead1和Mead2位点均进行孟德尔半显性遗传方式遗传，Mead1位点具有完全外显性；Mead2位点杂合时表现为不完全外显性，其外显率为16％；位点为纯和时，则表现为完全外显性。2．通过对建立同类系过程中Mead1位点为等位基因杂合的Eya1^bor／bor基因型小鼠的耳蜗与Mead1位点内更多的遗传标记位点关联，将Mead1位点缩小到标记D4Mit227和D4Mit171之间，大小为5．4cM。3．通过对建立同类系过程中Mead2位点为等位基因纯和的Eya1^bor／bor基因型小鼠的耳蜗与Mead2位点内更多的标记位点的关联，将Mead2位点缩小到标记D12Mit56和D12Mit283之间，大小为4．4cM。第五部分建立C3Fe．CAST和C3Fe．BALA同类系验证Mead1，Mead2和Mead3位点[目的]通过建立C3Fe．CAST和C3Fe．BALA两种同类系以验证并分析Mead1，Mead2和Mead3位点的作用。[方法]建立C3Fe．CAST^{mead1／mead1}同类系1个，C3Fe．CAST^{mead2／mead2}同类系1个，C3Fe．CAST^{mead3／mead3}同类系3个；建立C3Fe．BALA^{mead1／mead1}同类系1个，C3Fe．CAST^{mead2／mead2}同类系2个。方法同第四部分。[结果]1．C3Fe．CAST^{mead1／mead1}同类系：13只C3Fe．CAST^{Mead1／Mead1}-Eya1^bor／bor小鼠都有耳蜗发育，范围为1／2-3／4周，一只为1／4周，与C3Fe．B6^{Mead1／Mead1}-Eya1^bor／bor小鼠耳蜗周数为1-11／4周结果不同。2．C3Fe．CAST^{mead2／mead2}同类系：4只C3Fe．CAST^{Mead2／Mead2}-Eya1^bor／bor小鼠均有耳蜗发育，范围为1／2-3／4周，与C3Fe．B6^{Mead2／Mead2}-Eya1^bor／bor小鼠耳蜗周数基本相同。3．3个C3Fe．CAST^{mead3／mead3}同类系：3个同类系表现出不同的外显率，同类系501得到C3Fe．CAST^{Mead3／Mead3}-Eya1^bor／bor小鼠14只，其中只有8只（57％）小鼠有耳蜗发育，范围为3／4-1周；同类系504最后得到的18只C3Fe．CAST^{Mead3／Mead3}-Eya1^bor／bor小鼠中8只（44％）有耳蜗发育，范围为1／4-1 1／4周；同类系505最后得到16只C3Fe．CAST^{Mead3／Mead3}-Eya1^bor／bor小鼠中8只（50％）有耳蜗发育，范围为1／4-1／2周。4．C3Fe．BALA^{mead1／mead1}同类系（Mead1位点距小鼠4号染色体着丝粒5-10cM）：C3Fe．BALA^{Mead1／Mead1}-Eya1^bor／bor小鼠4只都有接近1 1/2周耳蜗发育，与C3Fe．B6^{Mead1／Mead1}-Eya1^bor／bor小鼠耳蜗周数为1-1 1/4周结果相近。5．2个C3Fe．BALA^{mead2／mead2}同类系（Mead2位点距小鼠12号染色体着丝粒约10cM）：C3Fe．BALA^{Mead2／Mead2}-Eya1^bor／bor小鼠共7只均见耳蜗发育，范围为1／2-1 3／4，变化范围较大，与C3Fe．B6^{Mead2／Mead2}-Eya1^bor／bor小鼠耳蜗周数不同。[结论]各个种属和各个位点的保护性等位基因的外显性和抑制作用有不同。这些不同表现在C3Fe．CAST^{Mead1／Mead1}-Eya1^bor／bor小鼠和C3Fe．B6^{Mead1／Mead1}-Eya1^bor／bor小鼠耳蜗周数不同。这说明CAST／EiJ和C57BL／6这两个鼠种在Mead1位点的发挥抑制性的作用不同。Mead1和Mead2位点对突变小鼠耳蜗发育不全的抑制作用与Mead3位点有很大不同。当三种保护性等位基因（CAST／EiJ，C57BL／6J，BALA／cJ）在Mead1和Mead2位点纯合时，对耳蜗发育不全的抑制作用表现出完全外显性；而在Mead3位置，C3Fe．CAST^{Mead3／Mead3}-Eya1^bor／bor小鼠存在不完全外显性（50％），以及广泛的耳蜗周数变化。