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背景白血病是一种常见的肿瘤疾病,在我国,白血病的发病率可以排到各类肿瘤疾病发病率的第六位[1]。目前,医学上主要通过化学治疗来治疗白血病[2],随着医疗水平的不断提高,不断涌现出新的化疗药物及化疗方案。然而,不管采用哪种化疗药物、化疗方案、化疗过程中产生的肿瘤多药耐药（MDR）[3],都可能使化疗效果减弱,甚至失败。出现MDR的原因较为复杂,有多种基因参与其中[4]。造成MDR的主要原因是肿瘤细胞膜泵送功能变强,细胞中P糖蛋白（P-gp）含量增多,使得细胞中药物浓度较低,药效不能正常发挥[5,6]。由于核转录因子红细胞系相关因子-2（Nrf2）可以有效调控P-gp的合成,进而影响肿瘤细胞的MDR,因此,研究Nrf2抑制剂成为治疗白血病及抑制白血病肿瘤MDR的一种有效方法,被国内外学者进行广泛研究。内质网应激（ERS）在一定程度上能够发挥保护细胞的作用,但当ERS强度过高时,会促进细胞凋亡[7,8]。利用ERS这一特点诱导细胞凋亡,可以为肿瘤治疗提供新的思路。被激活的IRE1α能够招募肿瘤坏死因子受体相关因子2（TRAF2）,TRAF2和ASK1组成IRE1α-TRAF2-ASK1蛋白复合体,并激活JNK或应激活化蛋白激酶（SAPK）,最终开启细胞的凋亡信号[8,9]。目的由于目前常见耐药逆转剂由化学药品合成,其功效单一,且副作用十分明显,在很大程度上限制了其应用空间。而中药种类繁多、药效广泛,且副作用小[10],因此,人们将目光转向中药的研究,尝试从中药中寻找高效的耐药逆转剂。研究发现,从中药蟾酥中提取获得的蟾毒灵[11,12]（bufalin）对白血病细胞的增殖以及耐药有很好的抑制作用[13]。我们拟选用bufalin做为研究对象,取其“以毒攻毒”来观察bufalin对K562/A02耐药的逆转作用以及对K562/A02的凋亡诱导作用并分析bufalin在抑制肿瘤MDR基因转录、诱导肿瘤细胞凋亡等方面的机制。本试验的目的是观察bufalin对K562/A02的耐药逆转作用以及bufalin对K562/A02的凋亡诱导作用,并对其可能存在的机制进行了探讨研究。方法和结果1、蟾毒灵对K562/A02细胞MDR的逆转作用（1）应用MTT检测耐药倍数为59.77,耐药逆转倍数为2.97倍;流式细胞术检测细胞内ADM浓度后发现加入bufalin后,K562/A02细胞中的ADM荧光强度比加药前明显增强,而Nrf2 siRNA组细胞的荧光强度则较K562/A02+ADM+bufalin组明显增强,差异有统计学意义（P<0.01）;（2）应用RT-PCR、Western blot检测蟾毒灵对Nrf2相关基因和耐药基因的表达。（1）结果发现K562/A02细胞Nrf2、MDR1 mRNA水平较K562的表达明显增强,而bufalin组K562/A02的Nrf2、MDR1 mRNA则明显降低,对Nrf2基因进行干扰后发现,Nrf2、MDR1 mRNA表达较K562/A02组明显降低（P<0.01;P<0.01;P<0.01）;（2）通过Western blot检测发现,蟾毒灵能抑制Nrf2以及其靶基因HO-1和P-gp蛋白的表达水平（P<0.01;P<0.01;P<0.01）,而对Nrf2 siRNA组相关蛋白检测表明HO-1和P-gp蛋白的表达较未干扰组明显较弱（P>0.05）,这与RT-PCR检测的结果一致,而此时干扰组K562/A02细胞内的荧光强度明显增强,说明对Nrf2进行干扰后K562/A02对ADM的敏感性增加。2、蟾毒灵对K562/A02细胞凋亡的诱导作用（1）应用MTT检测终浓度分别为0、12.5、25、50、100nM的bufalin K562/A02细胞的OD值,结果发现,蟾毒灵对K562/A02细胞的抑制作用具有时间浓度依赖性;（2）应用流式细胞仪检测细胞凋亡发现:bufalin组细胞的凋亡率较K562/A02细胞明显增高（P<0.01）;（3）应用RT-PCR检测细胞mRNA表达发现,蟾毒灵组内质网标志蛋白GRP78,94的mRNA表达明显升高（P<0.01）;而对凋亡相关基因Bax,Bcl-2 mRNA的检测发现,蟾毒灵组细胞Bax/Bcl-2的比值较K562/A02组升高（P<0.01）。（4）Western blot对凋亡相关蛋白的表达进行检测,Bax,cycto c,PAPR蛋白的表达蟾毒灵组明显升高,而Bcl-2的表达则降低（P<0.01;P<0.01;P<0.01;P<0.01）;蟾毒灵组K562/A02细胞内质网细胞相关蛋白IRE1α、TRAF2、JNK、p-JNK,Caspase-12的表达升高（P<0.01;P<0.01;P<0.01;P<0.01）。（5）为了说明在蟾毒灵诱导K562/A02细胞凋亡的作用,我们对细胞进行了IRE1αsiRNA,JNK siRNA:（1）应用流式细胞仪对组细胞进行细胞凋亡检测发现:干扰组细胞的凋亡率较正常细胞组明显降低;（2）对IRE1αsiRNA组进行IRE1α,JNK,p-JNK,Caspase-12 mRNA检测发现表达均明显降低（P<0.01）,对JNK siRNA组细胞进行JNK,Caspase-12 mRNA检测,结果表明JNK,Caspase-12 mRNA明显降低。IRE1αsi RNA和JNK si RNA组Bax/Bcl-2 mRNA比值较未干扰组明显降低（P<0.01）。对各干扰组进行相关蛋白检测发现,结果同PCR结果一致。结论1.蟾毒灵通过Nrf2来发挥逆转K562/A02细胞耐药作用;2.蟾毒灵通过IRE1α/TRAF2/JNK/Caspase-12途径诱导细胞凋亡