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研究背景:胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率较高,预后较差,因此寻求高效、低毒、多靶点、副作用小的抗胃癌药物具有重要的临床意义。类叶牡丹（Caulophyllum robustum Maxim）又称红毛七,为小檗科红毛七属植物,根状茎粗短可药用,它主要含有生物碱、三萜皂苷、黄酮、甾醇等成分,具有抗肿瘤、祛风通络、活血调经、止痛、抑菌抗炎等效用。主要用于类风湿性关节炎、胃痛、高血压等疾病的治疗,但类叶牡丹与肿瘤之间的研究甚少,尤其与胃癌的研究尚无报道。我们的前期实验结果表明,类叶牡丹提取物（Caulophyllum robustum Maxim extract,CRME）对正常胃粘膜上皮细胞GES-1的毒性作用小,对胃癌HGC-27等细胞具有显著抑制细胞增殖作用,但其对细胞凋亡和自噬的影响需进一步研究。局部黏着斑激酶（Focal adhesion kinase,FAK）蛋白表达水平与胃癌、乳腺癌、肺癌等多种癌症相关,FAK介导PI3K/AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,m TOR）信号通路和MMP、Snail、Vimentin等蛋白表达,在调节肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为有十分重要的作用。因此,本论文旨在研究CRME对胃癌HGC-27细胞的增殖、迁移、凋亡、自噬、周期等影响及其通过调控FAK、PI3K/AKT/m TOR信号通路发挥抑制胃癌HGC-27细胞可能的分子机制。目的:探讨CRME对胃癌HGC-27细胞的抑制作用及可能的分子机制。材料与方法:1.材料:胃癌HGC-27细胞由延边大学肿瘤研究中心提供。类叶牡丹由延边大学药学院吕慧子教授鉴定为正品。类叶牡丹提取物（CRME）由延边大学药学院安仁波教授团队提供。2.方法:（1）MTT增殖实验:1)不同细胞密度的正常胃粘膜上皮细胞GES-1及胃癌细胞HGC-27、SGC-7901、MGC-803进行增殖曲线检测,筛选最佳的胃癌细胞及细胞密度;2)用不同浓度的CRME处理HGC-27细胞,检测24h、48h、72h的细胞增殖能力。（2）平板克隆形成实验:用不同浓度的CRME处理HGC-27细胞,检测集落形成能力;（3）划痕愈合实验:用不同浓度的CRME处理HGC-27细胞,检测0h、24h、48h的细胞横向迁移能力;（4）Transwell小室迁移实验:用不同浓度的CRME处理HGC-27细胞,检测48h的细胞纵向迁移能力;（5）Hoechst33342染色:用不同浓度的CRME处理HGC-27细胞,检测48h的细胞凋亡小体形成情况;（6）流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染色法:用不同浓度的CRME处理HGC-27细胞,检测48h的细胞凋亡率;（7）AO吖啶橙染色:用不同浓度的CRME处理HGC-27细胞,检测48h的细胞自噬发生情况;（8）流式细胞术Annexin PI单染色法:用不同浓度的CRME处理HGC-27细胞,检测48h的细胞周期;（9）蛋白印迹实验:用不同剂量的CRME处理或用慢病毒转染（Sh FAK）或用PI3K抑制剂（LY294002）处理后,检测EMT相关标志物蛋白、MMP家族蛋白、凋亡相关蛋白、自噬相关蛋白、周期相关蛋白的表达水平及FAK和PI3K/AKT/m TOR信号通路相关蛋白的表达水平。结果:1.MTT增殖实验:（1）细胞增殖曲线结果显示:GES-1、MGC-803、SGC-7901、HGC-27细胞均在1×10~4/孔细胞密度时呈对数增长,选择最适合的1×10~4/孔的HGC-27细胞进行本论文的研究;（2）HGC-27细胞分别以0μg/m L、20μg/m L、40μg/m L、60μg/m L、80μg/m L、100μg/m L的CRME处理24h、48h、72h,结果显示:与对照组相比,CRME用药组的细胞增殖能力明显受到抑制,且呈剂量和时间依赖性（P<0.05或P<0.01）;CRME处理胃癌HGC-27细胞48h时的IC50值为41.49μg/m L,故选用0μg/m L（对照组）、20μg/m L、40μg/m L、60μg/m L的CRME进行后续实验;2.平板克隆形成实验结果显示:与对照组相比,CRME用药组的细胞集落形成能力明显受到抑制,且呈剂量依赖性（P<0.01）;3.划痕愈合实验结果显示:与对照组相比,CRME用药组的细胞横向迁移能力在24h和48h时均明显受到抑制,且呈剂量依赖性（P<0.01）;4.Transwell小室迁移实验结果显示:与对照组相比,CRME用药组的细胞纵向迁移能力明显受到抑制,且呈剂量依赖性（P<0.01）;5.Hoechst33342染色结果显示:与对照组相比,CRME用药组的细胞凋亡小体形成的数量明显增多,且呈剂量依赖性（P<0.01）;6.流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染色法结果显示:60μg/m L的CRME处理与其他组比较的细胞凋亡率均显著上调（均P<0.01）;7.AO吖啶橙染色结果显示:60μg/m L的CRME处理组与其他组比较橙红色酸性自噬泡均明显增多（P<0.01）;8.流式细胞术Annexin PI单染色法检测细胞周期结果显示:与对照组相比,经20μg/m L和40μg/m L的CRME处理后细胞阻滞于G0/G1期（P<0.05）,而用60μg/m L的CRME处理后G0/G1期与对照组相比虽有增加趋势,但无统计学意义（P>0.05）;9.蛋白印迹实验结果显示:（1）与对照组相比,CRME用药组细胞的E-cadherin蛋白表达水平升高,而Vimentin、Snail蛋白以及MMP家族MMP9、MMP2的蛋白表达水平降低（P<0.05或P<0.01）;（2）凋亡相关蛋白Bax、Cleaved-caspase 9、Cleaved-PARP、Cleaved-caspase 3的表达水平升高,而Bcl-2蛋白表达水平及Bcl-2/Bax降低（P<0.05或P<0.01）;（3）自噬标记蛋白LC3II/LC3I、Beclin1蛋白的表达水平升高提示自噬体形成增加,而p62蛋白的表达水平也升高则说明自噬流受到抑制（P<0.05或P<0.01）;（4）细胞周期G0/G1期相关蛋白CDK6、CDK4、Cyclin D1蛋白的表达水平降低,而p21蛋白表达水平升高（P<0.05或P<0.01）;（5）PI3K/AKT/m TOR信号通路相关蛋白PI3K、AKT、m TOR、4EBP1蛋白的磷酸化水平降低（P<0.05或P<0.01）,其相关总蛋白表达水平则无明显变化（P>0.05）;（6）FAK信号通路中,FAK蛋白的磷酸化水平降低（P<0.05或P<0.01）,其FAK总蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）;（7）与对照组比较,HGC-27细胞用Sh FAK慢病毒转染（HGC-27/Sh FAK）组与合用40μg/m L的CRME组的FAK、PI3K、AKT、m TOR蛋白磷酸化水平均降低（P<0.01）;而与HGC-27/Sh FAK组比较,合用40μg/m L的CRME组的FAK、PI3K、AKT、m TOR蛋白的磷酸化水平降低更为明显（P<0.05或P<0.01）,其相关总蛋白的表达水平则无明显变化（P>0.05）;（8）HGC-27细胞用PI3K抑制剂LY294002处理后与对照组相比,FAK蛋白的磷酸化水平无明显变化（P>0.05）,而PI3K蛋白的磷酸化水平降低（P<0.01）,FAK与PI3K总蛋白无明显变化（P>0.05）。结论:1.CRME具有抑制胃癌HGC-27细胞增殖和迁移能力,诱导细胞凋亡,诱导自噬体形成并抑制自噬流,阻滞细胞周期于G0/G1期,抑制EMT的作用;2.CRME对胃癌HGC-27细胞的影响与其调控FAK/PI3K/m TOR信号通路蛋白表达水平相关。