RNA干扰沉默TGFBR1基因对人结肠癌.lovo细胞EMT的影响

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目的研究RNA干扰沉默转化生长因子β受体1型(transforming growth factor-beta receptor1,TGFBR1)基因表达对人结肠癌lovo细胞株增殖、凋亡及其上皮间质转化EMT(epithelial-mesenehymal transition,EMT)的影响,初步探讨TGFBR1在结肠癌细胞浸润转移发展过程中的作用机制。方法将正常生长的人结肠癌Lovo细胞分为四组:小干扰TGFBR1Silencer组、空白对照Normal组、阴性对照Vector组及荧光对照Cy3组。通过设立Cy3荧光对照组对Lovo细胞瞬时转染siRNA的转染效率进行鉴定。在转染效率达到70%以上之后,对小干扰(TGFBR1Silencer组)、Vector(阴性对照组)和Normal(空白对照组)三组的细胞分别提取总RNA,利用逆转录PCR法对各组细胞中的目的基因TGFBR1、转录因子Twist、Snail、上皮细胞标记基因E-cadherin(CDH1)、Vimentin(VIM)的基因表达水平进行检测;同时提取总蛋白,利用Western-blot法对以上基因的蛋白水平的进行检测;CCK-8法检测沉默TGFBR1基因之后对Lovo细胞株增殖所产生影响;通过流式细胞术对瞬时转染之后Lovo细胞株的凋亡和细胞周期进行检测。结果通过化学合成小干扰siRNA,对TGFBR1Silencer组、Vector(阴性对照组)及荧光对照组进行瞬时转染,Normal(空白对照组)则暂不做处理。在培养24、48、72h以后,通过荧光对照组初步观察其转染效率,待转染效率达到了70%以后,对Silencer组、V ector组、Normal组的细胞分别提取RNA,进行RT-PCR实验,结果显示,Silencer组T GFBR1基因表达较阴性对照组和空白组明显被抑制(0.2132±0.012vs0.5987±0.031vs0.6065±0.026,P<0.05);另外,Twist(0.2352±0.022vs0.5372±0.023vs0.5813±0.017,P<0.05)、Snail(0.2549±0.015vs0.6135±0.014vs0.5491±0.011,P<0.05)、VIM(0.2054±0.012vs0.5532±0.016vs0.5117±0.019,P<0.05)的基因表达也明显受到抑制;CDH1(0.5421±0.021vs0.2125±0.013vs0.2343±0.015,P<0.05)的基因表达则明显升高,阴性对照和空白组对照之间各基因的表达差异则不具有统计学意义(P>0.05)。通过使用cck-8法进行细胞增殖检测,结果发现,Silence组Lovo细胞增殖活性显著低于阴性和空白对照组,24h(0.431±0.037vs0.213±0.057vs0.387±0.107,P<0.05),48h(0.783±0.102vs0.486±0.158vs0.805±0.112,P<0.05)。利用流式细胞仪对Silencer组、Vector组、Normal组细胞周期进行检测,结果发现,干扰TGFBR1基因表达后,Silencer组细胞周期被阻滞于G1/G0期,与阴性和空白对照组相比较,Silencer组Lovo细胞S期细胞数明显降低,而G1期细胞数明显增加(S期(23.48±3.97)%vs(38.27±4.67)%,P<0.01);同时,利用AnnexinV-PI双染色法和DAPI染色法对三组细胞进行细胞凋亡检测,其中,使用AnnexinV-PI双染色法经流式细胞仪检测发现,Silencer组早期凋亡百分数较阴性和空白对照组显著增高(P<0.05);使用DAPI染色时,与Vector组和Normal组相比,Silen cer组的细胞核浓缩且染色加深,染色质碎裂呈块状,整体细胞体积变小,提示细胞出现凋亡。Western blot印迹实验表明,Silence组中的TGFBR1、Twist、Snail和VIM蛋白表达较阴性和空白对照组明显被抑制,TGFBR1(0.2085±0.016vs0.5254±0.023vs0.4937±0.036,P<0.05)、Twist(0.1569±0.015vs0.4891±0.027vs0.5237±0.041,P<0.05)、Snail(0.2016±0.021vs0.5217±0.016vs0.5814±0.026,P<0.05)、VIM(0.2537±0.031vs0.7952±0.027vs0.7136±0.019,P<0.05);CDH1的蛋白表达则明显升高,CDH1(0.3571±0.018vs0.1772±0.052vs0.1654±0.038,P<0.05),阴性对照和空白对照之间,这五种蛋白表达水平的差异则不具有统计学意义(P>0.05)。结论小干扰TGFBR1siRNA成功转染入人结肠癌Lovo细胞株,并有效的抑制了TGFBR1基因的表达。RNA干扰沉默TGFBR1基因,可抑制人结肠癌Lovo细胞的增殖并促进其细胞凋亡;抑制Twist、Snail、VIM表达,促进CDH1表达,在上皮-间质细胞转化过程中起到了一定程度的抑制作用。TGFBR1基因可能是肿瘤发生侵袭转移的重要分子标志。而RNA干扰方法可能使结肠癌细胞瘤抗浸润转移治疗成为一种新的治疗选择。
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