禽流感(AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染病。自1878年意大利首先发现至今,世界各地都有特定毒株引起的禽流感爆发和流行,导致禽类的大量死亡和生产性能的急剧下降,造成了巨大的经济损失。目前,高致病性禽流感(HPAI)是国际兽疫局规定的A类动物传染病。近年来,禽流感的发生与流行,在我国已造成了巨大的经济损失和严重的社会影响,尤其是香港1997年和东南亚2003-2004年出现的禽流感病毒(AIV)直接感染并致死人的事件,已引了世人的震惊和关注。其防制已直接关系到我国养禽业的持续稳定发展和人民的身体健康。本研究主要是建立一种快速的检测禽流感病毒抗原的ELISA方法,弥补其它检测方法的不足,为该病的早期诊断提供可靠依据和技术保证;另外,由于禽流感病毒亚型之多,不同亚型之间无交叉保护作用,给该病的防制带来了极大的困难,鉴于此,本研究试图利用霍乱毒素B亚基(Cholera toxin B subunit, CTB)强有力的粘膜免疫佐剂作用,将禽流感病毒型特异性NP基因的表达产物与CTB混合或与CTB融合表达后,制成疫苗通过鼻腔粘膜免疫鸡,以期提高鸡体鼻腔、气管粘膜表面sIgA的含量,从而达到预防和控制禽流感的目的。主要研究工作和结果如下: 1.鸡抗AIV、兔抗AIV和山羊抗兔IgG高免血清的制备及山羊抗兔IgG的HRP标记 将H9N2亚型的AIV经9-11日龄鸡胚传代后,收获鸡胚尿囊液,经30,000r/m离心1h后,AIV沉淀用原尿囊液1/30倍体积的0.01mol/L,pH7.2的PBS重悬,所得悬液与福氏佐剂乳化后免疫鸡和兔,得到鸡抗AIV和兔抗AIV的高免血清,其琼扩效价均达到1:64;同时,以纯化的兔IgG免疫山羊,将获得的山羊抗兔IgG高免血清(1:64)纯化后,经辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG,制备出特异性强、免疫学活性和催化活性高的山羊抗兔IgG-HKP,且工作浓度高达1:4000,为禽流感的夹心ELISA诊断方法的建立奠定了坚实的物质基础。 2.检测禽流感病毒的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法的建立 以纯化的鸡抗AIV IgG为包被抗体,兔抗AIV IgG为第二抗体,通过ELISA反应条件的优化选择,建立了检测AIV抗原的夹心ELISA法。结果表明,鸡抗AIV IgG的最佳包被浓度为1μg/mL,兔抗AIV IgG的最适工作浓度为5μg/mL;对已知的阳性样品,用夹心ELISA法测得的病毒滴度比血球凝集滴度高16倍以上,且能检出其它亚型的禽流感病毒;与新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、减蛋综合征病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、鸡痘病毒、马立克氏病病毒等无交叉反应,说明该方法有很高的特异性和敏感性。对14个鸡场送检的患有呼吸道疾病或有腹膜炎、眼炎、产蛋下降、怀疑为禽流感感染的病鸡进行了检测,结果有7个鸡场为阳性。