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膜蛋白在细胞活动中占有非常重要的地位,但膜蛋白的表达和制备却相当困难。我们将多角体蛋白与膜蛋白PMP22融合,以探索该膜蛋白基因的高效表达方法。我们从本实验室所构建的家蚕cDNA文库中筛选到一条阅读框为561 bp,编码186个氨基酸残基的序列,生物信息学分析发现其编码的蛋白质预测分子量为22 kD,等电点为10.41,为家蚕过氧化物酶体膜蛋白。该蛋白含有一个属于Mpv17_PMP22超家族的保守结构域,并具有4个强疏水性的跨膜区,为整合膜蛋白,将其命名为家蚕PMP22(Peroxisomal membraneprotein22),GenBank登录号为:LOC733112。
本研究将PMP22基因的ORF插入质粒pBacPAK8-Ph的多克隆位点,获得含融合基因Ph-PMP22的重组质粒。大量扩增该重组质粒后,双酶切获得Ph-PMP22,再将其克隆到原核表达载体pET-28a上,成功构建了重组表达质粒pET-28a-Ph-PMP22,经PCR、酶切及测序鉴定后,获得正确的重组质粒。将该重组质粒分别转化大肠杆菌BL21 star(DE3)、BL21(DE3)及Rosetta(DE3),筛选得到三种工程菌,再分别接种培养,以终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导后加热裂解菌体进行SDS-PAGE电泳分析,结果表明没有明显的特异性表达条带,加大诱导时间后也没有明显改变;Westernblot检测发现融合蛋白在Rosetta菌中有一定表达,经SDS-PAGE凝胶扫描分析,目的蛋白含量有少量表达。利用Bac-to-Bac系统,我们将原核表达中获得的Ph-PMP22融合基因与质粒pFastBac重组,经PCR、酶切及测序鉴定筛选重组子pFastBac-Ph-PMP22,提取该重组子转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac,Bacmid与pFastBac-Ph-PMP22发生转座,获得含融合基因Ph-PMP22的重组Bacmid。以pUC/M13扩增引物进行PCR鉴定,结果表明重组成功。以重组的Bacmid转染家蚕BmN细胞,待发病后收集细胞,裂解细胞进行SDS-PAGE电泳分析,没有发现明显的特异性表达。而Western blot检测表明细胞破碎后的上清中不存在目的融合蛋白,沉淀中则存在少量目的融合蛋白,且表达量低于上述原核系统中的结果。