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蜜环菌属（Armillaria（Fr.:Fr.）Staude）是一类具有极高药用价值和食用价值的大型真菌,可与传统中药天麻（Gastrodia elata BI.）和猪苓（Polyporus umbellatus）共生。蜜环菌（Armillaria spp.）是天麻无性繁殖阶段的唯一营养供应源,其种类和生长状态影响着天麻的品质与产量。随着天麻栽培技术的逐渐成熟,人工栽培天麻的规模也逐渐扩大,蜜环菌菌种的需求量也相应提高。尤其是优质菌株,可以提高菌种培养的稳定性,提高生产效率,保证天麻优质优产。目的:云南省昭通市彝良县小草坝镇天麻基地的M1、M2菌株和吉林省白山市抚松县抽水乡天麻基地的F2、F3菌株可与天麻共生,在产区生产上大量使用,但所属种类与最佳培养条件未知。本论文旨在鉴定4株蜜环菌,并对菌株的特性进行研究,通过优质菌株的筛选、培养条件优化及继代培养等方面的研究,以期为两地天麻共生蜜环菌M1、M2、F2及F3菌株的菌种培育奠定基础。主要研究内容如下:方法:1.通过提取M1、M2、F2、F3菌株DNA,PCR扩增及克隆,以得到内部转录间隔区（Internal transcribed spacer,ITS）、β微管蛋白（Beta-tubulin,β-tubulin）及翻译延伸因子（Translation elongation factor-1 alpha,Tef1-α）三组基因片段的序列。经过峰图分析与多序列对比,对4个菌株的不同序列进行分析。将三组基因片段序列合并,构建系统发育树进行分类鉴定。2.培养过程中,观察M1、M2、F2及F3菌株的主要形态特征,采用ABTS法测定M1、M2、F2及F3菌株的胞外漆酶活性;DNS法测定纤维素酶、淀粉酶、木聚糖酶、果胶酶活性;采用硫酸-苯酚法测定菌株胞内多糖含量。3.以生物量为指标,采用单因素法对M1和F3菌株的培养温度、培养基p H、碳源、氮源、无机元素及维生素进行筛选;依据单因素筛选结果设计4因素3水平正交试验,对M1和F3菌株的培养条件进行优化。4.采用6种培养基,对M1和F3菌株黑暗条件下培养25天,移至温差在15℃～20℃,湿度为80%～90%,具有散射光的条件下,进行子实体诱导。5.应用垂直平板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）对M1-1至M1-10菌株进行酯酶同工酶电泳。6.通过考马斯亮蓝法测定M1-1至M1-10菌株可溶性蛋白含量。7.采用ABTS法和DNS法测定M1-1至M1-10菌株胞外漆酶、纤维素酶、淀粉酶、木聚糖酶、果胶酶酶活性;采用硫酸-苯酚法测定菌株胞内多糖含量。结果:1.获得M1、M2、F2及F3菌株的ITS、β-tubulin及Tef1-α三组基因片段的序列。通过多序列对比分析,4株蜜环菌的ITS序列差异较小,Tef1-α序列的差异最大。经系统发育分析,确定M1、M2菌株与高卢蜜环菌的参考序列HKAS85517聚为一支,F2、F3菌株与头柄蜜环菌的参考序列HKAS8584在同一分支上。2.M1、M2、F2及F3菌株胞外漆酶、纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、果胶酶活性的变化趋势呈现“单峰”形式,最高酶活性集中在培养的第12天。不同菌株的胞外酶活性存在一定差异,尤其是最高酶活性。4个菌株的多糖含量变化呈现低-高-低的趋势,F2和F3菌株的多糖含量在第8天最高,依次为1.869%和1.599%,M1和M2菌株在第12天最高,分别为2.14%和2.27%。3.单因素筛选结果显示,M1和F3菌株适于生长在弱酸性的环境中,最适p H值为5.0～6.0,最适培养温度为25℃。M1和F3菌株在不加碳源或氮源的培养基中生长状况较差,在单糖和甘露醇及可溶性淀粉为碳源的培养基中生长良好,麦芽糖和蔗糖生长较差。M1和F3菌株在有机氮源酵母粉和蛋白胨中生长最佳,在单一的无机氮源培养基中生长不佳。Mg SO4·7H2O和Ca Cl2对M1和F3菌株的生物量影响不显著,M1和F3菌株在KH2PO4和Mn SO4·H2O培养基中的生物量显著低于对照组。维生素对M1菌株的生物量无显著影响,对F3菌株的生物量具有显著的促进作用,VB1对F3菌株生物量的作用最明显。4.影响M1、F3菌株的生物量的主要因素为酵母粉和葡萄糖,Ca Cl2和VB1对M1、F3菌株的生物量的影响不显著。5.6号培养基成功诱导出M1菌株的子实体,未发现F3菌株的子实体。1-5号培养基没有长出M1和F3菌株的子实体。6.酯酶同工酶电泳结果显示,M1-1至M1-10菌株的酯酶同工酶的酶带数均为4条,第一条酶带较宽,颜色较深,从第二条酶带开始,酶带的宽窄及颜色深浅出现变化,但Rf值没有显著性差异。7.M1-1至M1-10菌株的可溶性蛋白含量部分呈现下降趋势,M1-8至M1-10菌株的可溶性蛋白含量低于M1-1至M1-6。M1菌株各代可溶性蛋白含量在18.680mg/m L～19.852 mg/m L之间,没有显著性差异（P>0.05）。8.胞外酶活性的变化趋势均呈现先上升后下降的趋势,并在第12天达到酶活性最高值。多糖含量呈现低-高-低的趋势,多糖含量最高值为第12天。通过差异性分析,M1各代之间的胞外酶活性和多糖含量没有显著性差异。结论:1.Tef1-α序列可以区分分类较为复杂的高卢蜜环菌（Armillaria gallica Marxm.&Romagn.）和头柄蜜环菌（Armillaria cepistipes Velen.）。经ITS、β-tubulin及Tef1-α联合序列构建的系统发育树分析,初步鉴定M1、M2菌株为A.gallica,F2、F3菌株为A.cepistipes。2.漆酶和淀粉酶活性最高为M1菌株,纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶活性最高为M2菌株。M1、M2菌株的多糖含量较高,不同蜜环菌生物种的多糖含量具有种间差异性。综合分析,筛选出M1和M2菌株为优质菌株。3.M1和F3菌株在单糖和甘露醇的培养基中生长状况较好,双糖培养基效果不佳。有机氮源可显著提高M1和F3菌株的生物量,氮源为影响菌株生物量的主要因素。最佳营养条件为葡萄糖25 g/L,酵母粉4 g/L,Ca Cl22 g/L,VB10.05 g/L。4.6号培养基培育出M1菌株的子实体,子实体诱导条件适用于M1菌株。5.在继代次数10次以内,M1菌株的酯酶同工酶、可溶性蛋白含量、胞外酶活性及菌株多糖含量较为稳定,菌株的活性未发生变化。