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目的:建立糖化血红蛋白A1c的HPLC测定方法。从正常人红细胞中分离和纯化A1c,并制备糖化血红蛋白A1c的多克隆抗体。
方法:以Bio-Rex70阳离子交换树脂为填料,在HPLC仪上采用梯度洗脱分离测定HbA1c,对50例健康人和50例糖尿病患者HbA1c进行测定。采集健康人全血,分离红细胞并制备溶血液,采用离子交换层析法和硼酸琼脂糖亲和层析法,分离和纯化HbA1c和HbA0。合成Hb的β链氨基末端六肽,经加入葡萄糖基团后,偶联到BSA上,制备免疫抗原。将该抗原(1.2 mg／ml)与等体积福氏完全佐剂乳化后,每只小鼠0.12 mg抗原皮下多点免疫Balb／c小鼠,于第3周、第5周和第7周加强免疫并采集尾静脉血测定效价,第8周摘取小鼠眼球收集血液,以酶联免疫吸附实验检测小鼠血清HbA1c抗体效价。
结果:Hb、HbA1c和HbA0的吸收光谱一致,吸收峰均为415 nm,HPLC-离子交换层析方法能使HbA1c与HbA1(a+b)、HbA0清楚分离,HbA1c峰面积或峰高与标本中HbA1c含量成正比。50例健康人HbA1c检测结果为3.3％～6.1％,50例糖尿病患者HbA1c检测结果为6.8％～14.4％。健康人红细胞溶血液,采用离子交换层析手工装柱分离提取HbA1c和HbA0峰值部分,HPLC法测定纯度分别为79.78％和97.42％,再经亲和层析纯化,HbA1c纯度可达94.5％,HbA0纯度可达99.7％。纯化抗原HbA1c可作为ELISA包被抗原来检测抗体效价,纯化抗原HbA0可作为ELISA包被抗原来检测交叉反应。合成抗原与福氏佐剂乳化后免疫Balb／C小鼠4次后,抗体效价达1:10000～1:100000。
结论:Bio-Rex70-HPLC法测定糖化血红蛋白具有精密度好、准确度高、线性范围宽等优点,可用于GHb或HbA1c常规方法的评价和临床标本的分析。合成的葡萄糖基Hb-β链氨基末端六肽偶联到BAS制备免疫抗原,免疫动物获得高效价的特异性抗体。实验结果提示,单一的离子交换方法分离糖化血红蛋白并不理想,必须与亲和层析结合,才能得到较高纯度HbA1c和HbA0。