目的:探讨外源性及内源性1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate,S1P）对心肌肥厚的调控作用及其可能的机制。方法:一、外源性S1P对心肌肥厚的调控作用1.乳鼠原代心肌细胞的提取及培养采用胰酶和II型胶原酶混合酶消化法及差速贴壁分离法提取乳鼠原代心肌细胞,应用含10%FBS及1%双抗的DMEM完全培养基对心肌细胞进行培养。2.外源性给予不同浓度梯度的S1P处理乳鼠原代心肌细胞培养48h后,采用不含血清的DMEM培养基进行饥饿处理24h,然后给予不同浓度的S1P继续培养24h,实验分组及处理如下:（1）正常对照组（C组）:饥饿处理24h后,使用DMEM培养基继续培养24h;（2）S1P100nM组（S1P100组）:饥饿处理24h后,使用含S1P终浓度为100nM的DMEM培养基继续培养24h;（3）S1P1μM组（S1P1组）:饥饿处理24h后,使用含S1P终浓度为1μM的DMEM培养基继续培养24h;（4）S1P10μM组（S1P10组）:饥饿处理24h后,使用含S1P终浓度为10μM的DMEM培养基继续培养24h。3.RT-qPCR法测定心肌肥厚相关因子ANP、BNP、MYH7mRNA表达提取各组乳鼠原代心肌细胞总RNA,逆转录法合成cDNA,并以此为模板进行RT-qPCR扩增反应,测定心肌肥厚相关因子ANP、BN、MYH7mRNA表达。4.Western Blot检测心肌肥厚相关因子ANP、BNP、MYH7蛋白相对表达水平5.免疫荧光标记法观察乳鼠原代心肌细胞心肌表面积的变化二、外源性S1P促进心肌肥厚作用与受体亚型相关性研究1.实验分组及给药处理将提取分离好的乳鼠原代心肌细胞培养48h后,随机分为8组,每组给予如下处理:（1）正常对照组（C组）:乳鼠原代心肌细胞正常培养48h后,饥饿处理24h,使用DMEM培养基继续培养24h;（2）S1P1μM处理组（S1P组）:乳鼠原代心肌细胞正常培养48h后,饥饿处理24h,使用含S1P终浓度为1μM的DMEM培养基继续培养24h;（3）S1PR₁受体阻断剂W146组（W146组）:乳鼠原代心肌细胞正常培养48h后,饥饿处理24h,使用含W146终浓度为10μM的DMEM培养基继续培养24h;（4）S1PR₂受体阻断剂JTE013组（JTE013组）:乳鼠原代心肌细胞正常培养48h后,饥饿处理24h,使用含JTE013终浓度为10μM的DMEM培养基继续培养24h;（5）S1PR₃受体阻断剂CAY10444组（CAY10444组）:乳鼠原代心肌细胞正常培养48h后,饥饿处理24h,使用含CAY10444终浓度为10μM的DMEM培养基继续培养24h;（6）S1P+W146组:乳鼠原代心肌细胞正常培养48h后,饥饿处理24h,使用含S1P终浓度为1μM,W146终浓度为10μM的DMEM培养基继续培养24h;（7）S1P+JTE013组:乳鼠原代心肌细胞正常培养48h后,饥饿处理24h,使用含S1P终浓度为1μM,JTE013终浓度为10μM的DMEM培养基继续培养24h;（8）S1P+CAY10444组:乳鼠原代心肌细胞正常培养48h后,饥饿处理24h,使用含S1P终浓度为1μM,CAY10444终浓度为10μM的DMEM培养基继续培养24h。2.Western Blot检测心肌肥厚相关因子ANP、BNP、MYH7蛋白相对表达水平3.免疫荧光标记法观察乳鼠原代心肌细胞心肌表面积的变化三、内源性S1P对心肌肥厚的调控作用1.血管紧张素II诱导乳鼠原代心肌细胞心肌肥厚模型的建立提取分离好的乳鼠原代心肌细胞正常培养48h后,换用无血清DMEM培养基饥饿处理24h,分别给予100nM、1μM AngII处理24h,RT-qPCR法测定心肌肥厚相关因子ANP、BNP、MYH7mRNA表达,Western Blot检测心肌肥厚相关因子ANP、BNP、MYH7蛋白相对表达水平,免疫荧光标记法观察乳鼠原代心肌细胞心肌表面积的变化。2.构建SK1、SK2过表达慢病毒载体,观察内源性S1P生成增多对心肌肥厚的影响构建和包装SK1、SK2过表达慢病毒载体并进行质量检测,用于感染乳鼠原代心肌细胞,确定MOI及最佳感染条件,将乳鼠原代心肌细胞分为CON335空病毒对照组（CON335组）、CON335空病毒对照+AngII 1μM（CON335+AngII组）、SK1过表达慢病毒组（SK1组）、SK1过表达慢病毒+AngII 1μM（SK1+AngII组）、CON294空病毒对照组（CON294组）、CON294空病毒对照+AngII 1μM组（CON294+AngII组）、SK2过表达慢病毒组（SK2组）、SK2过表达慢病毒+AngII1μM组（SK2+AngII组）,RT-qPCR测定SK1、SK2过表达慢病毒转染后各组肥厚相关因子ANP、BNP、MYH7mRNA表达量,Western Blot测定SK1、SK2过表达慢病毒转染后各组肥厚相关因子ANP、BNP、MYH7蛋白相对表达水平,免疫荧光观察SK1、SK2过表达慢病毒转染后各组心肌细胞表面积变化情况3.构建SK1、SK2敲减质粒载体,观察内源性S1P生成减少对心肌肥厚的影响构建SK1、SK2敲减质粒载体,感染乳鼠原代心肌细胞,将乳鼠原代心肌细胞分为8组即SK1敲减空质粒对照组（C1组）、SK1敲减空质粒对照+AngII1μM组（C1+AngII组）、SK1敲减质粒组（Si-SK1组）、SK1敲减质粒+AngII 1μM组（Si-SK1+AngII组）、SK2敲减空质粒对照组（C2组）、SK2敲减空质粒对照+AngII 1μM组（C2+AngII组）、SK2敲减质粒组（Si-SK2组）、SK2敲减质粒+AngII 1μM组（Si-SK2+AngII组）,RT-qPCR测定SK1、SK2敲减质粒转染后各组肥厚相关因子ANP、BNP、MYH7mRNA表达量,Western Blot测定SK1、SK2敲减质粒转染后各组肥厚相关因子ANP、BNP、MYH7蛋白相对表达水平,免疫荧光观察SK1、SK2敲减质粒转染后各组心肌细胞表面积变化情况。结果:一、外源性S1P对心肌肥厚的调控作用与C组相比,S1P100组,S1P1组、S1P10组ANP、BNP、MYH7mRNA表达量及蛋白相对表达水平以及心肌细胞表面积均明显增加;其中以S1P1组增加最明显。二、外源性S1P促进心肌肥厚作用与受体亚型相关性研究与S1P组相比,S1P+W146组、S1P+JTE013组ANP、BNP、MYH7蛋白相对表达水平明显降低,心肌细胞表面积明显减小,而S1P+CAY10444组ANP、BNP、MYH7蛋白相对表达水平;心肌细胞表面积均没有明显变化。三、内源性S1P对心肌肥厚的调控作用1.AngII诱导乳鼠原代心肌细胞心肌肥厚模型的建立与C组相比,AngII 100nM组、AngII 1μM组可明显增加ANP、BNP、MYH7mRNA表达量、蛋白相对表达水平以及心肌细胞表面积;与AngII 100nM组相比,AngII 1μM组作用更为明显。2.构建SK1、SK2过表达慢病毒载体,观察过表达SK对心肌肥厚的影响与CON335组相比,CON335+AngII组ANP、BNP、MYH7mRNA表达量及蛋白相对表达水平、心肌细胞表面积均明显增加,而SK1组上述指标无明显变化;与CON335+AngII组相比,SK1+AngII组ANP、BNP、MYH7mRNA表达量及蛋白相对表达水平均明显降低、心肌细胞表面积明显减小。提示过表达SK1可抑制AngII诱导的心肌肥厚。与CON294组相比,CON294+AngII组ANP、BNP、MYH7mRNA表达量及蛋白相对表达水平、心肌细胞表面积均明显增加,而SK2组上述指标无明显变化;与CON294+AngII组相比,SK2+AngII组ANP、BNP mRNA表达量及蛋白相对表达无明显变化,心肌细胞表面积亦未见明显变化。3.构建SK1、SK2敲减质粒载体,观察敲减SK对心肌肥厚的影响与C1组相比,C1+AngII组ANP、BNP、MYH7mRNA表达量及蛋白相对表达水平、心肌细胞表面积均明显增加,而Si-SK1组上述指标无明显变化;与C1+AngII组相比,Si-SK1+AngII组ANP、BNP、MYH7mRNA表达量及蛋白相对表达水平、心肌细胞表面积均明显增加;与C2组相比,C2+AngII组ANP、BNP、MYH7mRNA表达量及蛋白相对表达水平、心肌细胞表面积均明显增加,而Si-SK2组上述指标无明显变化;与C2+AngII组相比,Si-SK2+AngII组ANP、BNP mRNA表达量及蛋白相对表达水平无明显变化,心肌细胞表面积亦未见明显变化。结论:1.外源性S1P具有促进心肌肥厚的作用。2.外源性S1P促进心肌肥厚作用可能与激动S1PR₁、S1PR₂受体有关。3.SK1诱导生成的内源性S1P可抑制心肌肥厚的发生发展。4.SK2诱导生成的内源性S1P对心肌肥厚的发生发展没有影响。